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独参汤联合骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死大鼠的相关研究

作　者: 王祺
导　师: 杨积武
学　校: 辽宁中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 骨髓间充质干细胞 贴壁培养法 密度梯度离心法 独参汤 心肌梗死 心功能 血管内皮功能 VEGF ICAM-1 VCAM-1
分类号: R542.22
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


第一部分:大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定背景:干细胞是一门新兴的技术,其在体外具有自我更新及多向分化的潜能,采用细胞移植的方法干细胞可以用于治疗多种难治性疾病。骨髓间充质干细胞是目前研究最多的干细胞,但它在骨髓中的含量极低,约每100,000个单核细胞中仅含有2-5个,这使科学研究受到极大限制,要想为实验研究提供所需数量及纯度的骨髓间充质干细胞,就需要对其进行有效的体外扩增。因此,使用有效的分离、纯化、培养的方法尤显重要。目的:目前对骨髓间充质干细胞分离、纯化、扩增比较常用的方法有以下几种:贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠分离法、特制培养板筛选法和渗透压筛选法,且各有其优缺点。依据各方法之特点,结合研究需要,通过实验探索并验证行之有效的体外细胞分离、纯化、培养的方法。方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养。1.每次取Wistar雄性大鼠1只,断颈处死,浸于体积分数为75%乙醇中10分钟,无菌条件下取出大鼠的股骨及胫骨,剔除骨表面附着组织,用无菌PBS将表面冲洗干净。除去骨的两端,使骨髓腔暴露,再将骨关节面祛除后用注射器（60mL）抽取无菌的PBS将骨髓腔多次反复冲洗干净。2.将收集到的骨髓液加入预先加入50mL DMEM培养基的无菌离心管中,用注射器反复抽吸,将组织打散成为细胞悬液。在淋巴细胞分离液（1.077 Ficoll）上轻轻叠加刚得到的细胞悬液,离心20分钟（转速:2000r/min）,将单个细胞层吸取出来。用DMEM培养基将细胞漂洗两次,离心5分钟（转速:1000r/min）,弃去上清,留取细胞沉淀。然后向细胞沉淀中加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基。将细胞密度调整约为1×106/mL,接种于25cm2细胞培养瓶中,在恒温细胞培养箱（温度37℃,饱和湿度CO2体积分数为5%）中培养48小时后,更换培养基,除掉未贴壁细胞,之后每隔3天照此法换液1次。3.在80%左右的原代细胞融合时予以传代,弃掉旧的培养基,用无菌的PBS漂洗3次后加入0.25%胰酶,室温下进行消化约5分钟,待细胞形态变圆时将其加到含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中终止消化。用吸管轻轻吹打,再将消化液转入到15mL的无菌离心管中,离心10分钟（转速:1000r/min）。除去上清取出细胞沉淀,将其加入到含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中,按照1:2的比例进行传代。鉴定:用流式细胞学对传代后骨髓间充质干细胞表面标志CD44、CD90、CD34、CD45进行检测。结果:1.骨髓间充质干细胞形态观察:新分离接种的细胞镜下观察呈圆形,数量较多,大小不一; 48小时后见多数细胞贴壁生长,呈圆形或椭圆形,体积增大,大多数细胞为单核细胞,此后梭形细胞逐渐出现;7天后细胞多呈梭形,可见明显集落形成,并随集落的不断扩大,融合呈漩涡状或放射状;原代细胞10天左右达85%以上融合,传代后细胞约1周左右达85%以上融合;传至5代细胞形态呈较一致的长梭形。2.间充质干细胞流式检测: CD44阳性细胞占92.4%,CD90阳性细胞占88.9%,CD34阴性细胞占96.6%,CD45阴性细胞占95.6%。结论:运用贴壁培养法和密度梯度离心法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养,可获得足够数量纯度较高的骨髓间充质干细胞。第二部分:独参汤联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠心功能的影响背景:急性心肌梗死后心功能的改善程度直接关系到其预后,如何更好的改善心梗后心功能是目前热点话题。有研究发现,中药与骨髓间充质干细胞移植相结合可以起到协同增效、优势互补的作用,但选用何种中药对骨髓间充质干细胞进行干预能够对心功能起到更好的改善作用尚在探索之中。目的:观察独参汤联合骨髓间充质干细胞对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响。方法:选择雌性清洁级Wistar大鼠40只,采用Olivette方法结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。将造模后的大鼠随机分为4组:①急性心肌梗死对照组（ n=10）:大鼠心肌梗死后注射等量培养基;②干细胞组（n=10）:急性心肌梗死大鼠接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗（2×106 BMSCs /100μL,分4点注入）;③独参汤组（n=10）:大鼠急性心肌梗死后2小时开始灌服独参汤,每日二次,共用一周;④干细胞组+独参汤组（n=10）:大鼠急性心肌梗死后接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗（2×106 BMSCs /100μL,分4点注入）,2小时后开始灌服独参汤,每日二次,共用一周。分别于造模前及骨髓间充质干细胞移植后4周,对各组大鼠行心脏超声检查（左心室射血分数、每分钟心排出量）;于心脏超声检查后对各组大鼠心肌组织行HE染色。结果:1.超声心动图检查结果（1）左心室射血分数检测结果显示:①对照组、独参汤组、干细胞组、独参汤+干细胞组4组与术前比较均有明显降低（P<0.05）;②干细胞组、独参汤组和干细胞+独参汤组3组与对照组比较均有升高;其中干细胞+独参汤组升高最为明显;③干细胞组与对照组比较有明显差异（P<0.05 ）;④干细胞+独参汤组与对照组比较有显著差异（P<0.01）;与干细胞组比较有明显差异（P<0.05）;与独参汤组比较有显著差异（P<0.01）。（2）每分钟心脏排出量检测结果显示:①对照组、独参汤组、干细胞组、独参汤+干细胞组4组与术前比较均明显降低;②干细胞组、独参汤组和干细胞+独参汤组3组与对照组比较均有升高;其中干细胞+独参汤组升高最为明显;③干细胞+独参汤组与独参汤组比较有显著性差异（P<0.01 ）;④干细胞组和干细胞+独参汤组与对照组比较均具有显著性差异（P<0.01 ）,且干细胞+独参汤组优于干细胞组。2.心肌组织病理学结果（1）对照组大鼠心脏标本HE染色可见广泛心肌纤维化,心肌组织排列紊乱,伴有邻近心肌纤维萎缩（或）肥大,心肌组织之间夹杂有大量疤痕组织,并可见轻度的淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,脂肪样改变;（2）骨髓间充质干细胞移植组心脏标本HE染色示心肌组织间也有结缔组织增生,但没有发现血管瘤,小血管数量较为丰富。结论:1.独参汤对骨髓间充质干细胞在改善大鼠心梗后心功能方面有明显的促进作用。2.独参汤与骨髓间充质干细胞在改善大鼠心梗后心功能方面具有良好的协同增效作用。第三部分:独参汤联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠血管内皮功能的影响背景:前期实验提示独参汤联合骨髓间充质干细胞能够显著改善大鼠心肌梗死心功能,考虑心功能的改善可能与以下两方面因素有关:一是独参汤促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。二是通过改善血管内皮功能,促进微血管再生,改善梗死区及缺血区的血供使心功能得到改善。但仅以增加心肌细胞数量来改善心功能则需要大量心肌细胞,加上干细胞在移植区存活率较低,所以推测心功能的改善可能以血管内皮功能的改善为主。目的:通过对大鼠VEGF、ICAM-1和VCAM-1的检测,观察独参汤联合骨髓间充质干细胞是否对大鼠急性心肌梗死后血管内皮功能的改善有促进作用,以及独参汤与骨髓间充质干细胞在促进血管内皮功能改善方面是否有协同增效的作用。方法:在各组实验大鼠开胸取心脏标本前,开腹经腹主动脉取动脉血,将获得的动脉血经过离心后在-20℃冻存,用于血清VEGF、ICAM-1和VCAM-1的检测（具体操作步骤严格按试剂盒进行操作）;并对VEGF进行Western-Blot检测。结果:1. VEGF血清检测结果与Western-Blot检测结果一致如下:①独参汤组、干细胞组和独参汤+干细胞组各值均较对照组有升高。②干细胞组和干细胞+独参汤组与对照组比较有显著升高（P<0.01）。③干细胞+独参汤组较干细胞组升高显著（P<0.05）。2.血清ICAM-1和VCAM-1的检测结果:①独参汤组、干细胞组和独参汤+干细胞组各值均较对照组有降低。②干细胞组与对照组比较明显降低（P<0.05）。③干细胞+独参汤组与对照组比较降低显著（P<0.01）。结论:1.独参汤联合骨髓间充质干细胞可明显改善大鼠心肌梗死后血管内皮功能,提示心梗后心功能的改善可能与血管内皮功能的改善有密切关系。2.独参汤对骨髓间充质干细胞在改善大鼠心肌梗死后血管内皮功能方面有促进作用,且两者存在协同增效的作用。

全文目录


英文缩略词  4-5
中文摘要  5-11
英文摘要  11-19
前言  19-39
  文献综述一：中药干预骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死研究概况及展望  20-29
  文献综述二：骨髓间充质干细胞对心梗后心功能及血管内皮功能的影响  29-39
第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定  39-46
  1 实验材料  39-40
  2 实验方法  40-41
  3 结果  41-42
  分析讨论  42-45
  结论  45-46
第二部分：独参汤联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠心功能的影响  46-62
  1 实验材料  46
  2.急性心肌梗死动物模型制备及实验动物分组  46-47
  3 实验方法  47-49
  4.检测指标  49-51
  5 统计学方法  51
  6 结果  51-56
  分析讨论  56-61
  结论  61-62
第三部分：独参汤联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠血管内皮功能的影响  62-74
  1 实验材料  62
  2 实验方法  62
  3 检测指标  62-64
  4 统计学方法  64
  5 结果  64-68
  分析讨论  68-73
  结论  73-74
全文结论  74-75
参考文献  75-89
附图  89-92
致谢  92-93
个人简历  93-94

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