学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

p53在日本脑炎病毒复制及其致病性中的作用

作　者: 邓绪芳
导　师: 马志永
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本脑炎病毒 p53 NS3 复制致病性细胞凋亡先天性免疫力
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 92次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种经蚊虫传播,能引起人中枢神经系统损伤的黄病毒。目前控制日本脑炎病毒的主要手段是疫苗预防和蚊虫清除,但是全球每年仍有近50 000的病例和近30%的死亡率。因此,仍需要开发有效的抗病毒策略来弥补疫苗控制的不足。了解病毒与宿主细胞的相互作用,有利于寻找有效的抗病毒策略。p53具有抗肿瘤、DNA修复、促细胞凋亡和抗病毒等功能,许多病毒在感染过程中都与p53相互关联,但至今尚未见到JEV与p53相互作用的报道。为了探讨p53在JEV感染中的作用,我们开展了如下研究:1、JEV感染降低p53的蛋白水平和转录活性。本研究首先用JEV(SH-JEV01株)感染A549和PIEC细胞,用间接免疫荧光(IFA)和western blot方法检测细胞内p53的细胞定位和蛋白水平。IFA结果显示在感染细胞内,p53核聚集明显减少,并且这种减少是一种普遍现象;western blot结果显示,JEV感染A549细胞48h或感染PIEC细胞12h后,p53蛋白逐渐减少;将细胞质和细胞核进行分离,Western blot结果显示细胞质和胞核内的p53均减少。通过p53荧光素酶活性分析,JEV感染后细胞内p53活性显著下降(p<0.05);Western blot结果显示p53靶基因IRF9的表达明显减少。另外,IFA结果显示,在JEV感染细胞内NS3与p53存在细胞共定位现象;免疫共沉淀试验(co-IP)证实NS3能与p53结合。通过这部分的研究,我们首次发现JEV感染能降低p53蛋白水平和活性,并证实NS3蛋白与p53相互结合,提示NS3可能参与了对p53功能的影响。2、p53抑制JEV的复制。为了观察p53对JEV复制的影响,本研究通过RNAi技术将A549细胞内p53进行基因沉默,然后观察JEV的复制。通过western blot和定量PCR分析,发现转染150nM siRNA 48h后能有效的将p53基因沉默,并通过细胞活率测定和流式细胞分析,证实转染p53 siRNA在短期内不影响细胞的生长特性及细胞周期。将JEV感染p53基因沉默的A549细胞,IFA试验显示p53基因沉默组NS3阳性的细胞数明显增多;定量PCR试验表明,p53基因沉默细胞中NS3 mRNA水平显著高于对照组(p<0.01);Western blot结果表明,p53基因沉默细胞中NS3、E蛋白的表达明显高于对照组;空斑试验数据显示,p53基因沉默细胞产生的病毒粒子明显多于对照组(10~100倍)。上述结果说明,在细胞模型中p53能有效抑制JEV的复制。3、JEV诱导的细胞凋亡不依赖p53。为了观察p53在JEV诱导细胞凋亡中的影响,将JEV感染p53基因沉默的A549细胞,分析细胞凋亡的情况。通过台盼蓝排斥试验,发现JEV感染p53基因沉默细胞后,引起更多细胞的发生死亡(p<0.05);通过原位末端转移酶标记试验(TUNEL)和流式细胞术(Annexin V-PI)分析细胞凋亡情况发现,JEV感染p53基因沉默细胞诱导更多细胞发生凋亡(p<0.05)。从小鼠全基因表达芯片的结果中发现(见第六章),在JEV感染的p53基因敲除(p53KO)小鼠脑组织中,具有促凋亡活性的Xaf1表达水平要高于p53野生型(p53WT)小鼠89倍;定量PCR结果显示在JEV感染的p53基因沉默细胞中,Xaf1的表达显著高于对照组(p<0.05)。上述结果说明JEV诱导的细胞凋亡不依赖p53,反而由于p53的缺失,促进了JEV诱导的细胞凋亡。4、p53抑制JEV对小鼠的致病性。为了观察p53在JEV致病性中的作用,通过皮下注射将JEV感染p53KO和p53WT小鼠。结果发现,p53KO小鼠表现为症状出现早、病程短、死亡率高。通过定量PCR测定外周血中NS3 mRNA水平,结果显示JEV在感染后第3天病毒血症达到峰值,并且p53KO小鼠病毒血症显著高于野生型小鼠(p<0.05)。免疫组化结果显示,在p53KO小鼠脑组织中NS3抗原阳性的细胞数要明显多于p53WT小鼠。上述结果说明在小鼠体内p53也能抑制JEV的复制。病理切片的结果显示,p53KO小鼠脑组织中(大脑皮层和海马)的胶质细胞分泌更多的炎性渗出物。ELISA结果显示p53KO小鼠脑组织中TNF-α和IL-6的表达量要显著高于p53WT小鼠(p<0.05)。上述结果说明,JEV感染p53KO小鼠引起更严重的炎症反应。为了观察JEV感染后小鼠的免疫反应,本研究通过流式细胞分析了外周血和脾脏中DC, Mφ, CD4和CD8 T细胞的比例。结果发现,在未感染时,p53KO小鼠外周血中DC细胞的比例与p53WT小鼠比较没有显著差别,Mφ细胞则要明显低于p53WT小鼠;而在JEV感染后p53KO小鼠外周血中,DC和Mφ比例显著上升,而p53WT小鼠的比例没有显著变化。上述结果说明,p53影响了DC、Mφ的增殖,提示p53可能通过抑制DC和Mφ增殖,限制炎症相关因子的产生;在JEV感染小鼠脾脏中,p53WT的CD4 T细胞显著增殖,但是p53KO小鼠的CD4 T细胞的比例却没有变化。该结果提示p53可能通过调节CD4 T细胞的增殖,参与机体的免疫反应。5、小鼠脑组织全基因表达谱差异分析。为了探索p53抑制JEV复制及其致病性的机制,筛选潜在受p53调控的并参与JEV感染的基因,我们对小鼠脑组织进行了全基因表达谱分析。通过比较p53WT和p53KO小鼠差异表达基因,我们发现p53KO小鼠脑组织中,一部分炎症相关因子(趋化因子、白细胞介素和肿瘤坏死因子等)的表达上调,而一些与细胞先天性免疫相关分子表达下调,一些与凋亡相关的基因也有差异表达。另外还发现:JEV感染p53基因沉默细胞后IFITM3的表达减少;在p53KO MEF中过表达p53可以诱导IFITM3的表达;过表达p53或用5-Fu刺激能刺激IFITM3启动子的活性上升。这些结果说明,IFN诱导的抗病毒基因IFITM3可能受到p53的调控。综上所述,本课题从多方面多层次研究了JEV与p53的相互作用,分析了p53对JEV复制及致病性的影响,发现了一些JEV感染宿主过程中潜在受p53调控的相关分子和免疫细胞,进一步揭示了p53的先天性抗病毒免疫力和JEV的致病机理,为以后进一步研究p53抗JEV的分子机制和开发抗病毒药物提供有价值的数据。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-19
第一章文献综述  19-42
  1、日本脑炎病毒  19-31
    1.1 概述  19
    1.2 病毒的分类及地域分布  19-20
    1.3 病毒的组成与复制  20-22
    1.4 诊断与治疗  22-23
    1.5 疫苗  23
    1.6 病理学症状  23
    1.7 JEV分子致病机理  23-25
    1.8 JEV逃逸细胞先天性免疫的策略  25-31
  2、肿瘤抑制因子p53  31-38
    2.1 概述  31
    2.2 p53 与细胞凋亡  31-34
    2.3 p53 与先天性抗病毒免疫力  34-36
    2.4 p53 与免疫细胞的增殖分化  36-37
    2.5 p53 与炎症反应  37-38
  3、 p53 与病毒的相互作用  38-41
    3.1 p53 与DNA病毒  38-40
    3.2 p53 与RNA病毒  40
    3.3 p53 与黄病毒的研究  40-41
  4. 本研究目的及意义  41-42
第二章 JEV感染对p53 影响的研究  42-56
  1. 前言  42-43
  2. 材料与方法  43-47
    2.1 材料  43-44
    2.2 方法  44-47
  3. 结果  47-54
    3.1 JEV感染引起p53 蛋白核聚集减少  47
    3.2 JEV感染引起p53 蛋白蛋白水平下降  47-49
    3.3 JEV感染降低了p53 的转录活性  49-51
    3.4 NS3 与p53 在细胞中的共定位  51-53
    3.5 NS3 与p53 存在相互作用  53-54
  4. 讨论  54-56
第三章 p53 抑制JEV复制的研究  56-65
  1、前言  56-57
  2、材料与方法  57-58
    2.1 材料  57
    2.2 方法  57-58
  3、结果  58-64
    3.1 化学合成p53 siRNA介导的p53 基因沉默  58-59
    3.2 p53 基因沉默对细胞生长的影响  59-60
    3.3 p53 基因沉默促进了JEV的复制和蛋白表达  60-63
    3.4 p53 基因沉默对部分抗病毒基因表达的影响  63-64
  4、讨论  64-65
第四章 p53 对JEV诱导细胞凋亡的影响  65-72
  1、前言  65
  2、材料与方法  65-66
    2.1 材料  65
    2.2 方法  65-66
  3、结果  66-70
    3.1 p53 基因沉默促进了JEV诱导的细胞病变  66-67
    3.2 JEV引起不依赖p53 的细胞凋亡  67-69
    3.3 Xaf1 在小鼠脑组织中的表达  69
    3.4 p53 knockdown 促进了Xaf1 的表达  69-70
  4、讨论  70-72
第五章 p53 在JEV致病性中的作用  72-85
  1、前言  72-73
  2、材料与方法  73-76
    2.1 材料  73
    2.2 方法  73-76
  3、结果  76-82
    3.1 p53KO小鼠的鉴定  76-77
    3.2 JEV对p53KO小鼠的致死率增强  77
    3.3 p53 抑制JEV在小鼠体内复制  77-79
    3.4 JEV感染p53KO小鼠引起更严重的炎症反应  79-80
    3.5 JEV感染p53KO小鼠对体内免疫细胞增殖的影响  80-82
  4、讨论  82-85
第六章 JEV感染小鼠脑组织的全基因表达谱差异分析  85-98
  1、前言  85
  2、材料与方法  85-87
    2.1 材料  85
    2.2 方法  85-87
  3、结果与讨论  87-97
    3.1 小鼠全基因表达谱差异分析  87-88
    3.2 JEV感染p53WT小鼠差异表达基因分析  88-91
    3.3 JEV感染p53KO和p53WT小鼠差异表达基因分析  91-94
    3.4 p53 调控抗病毒基因IFITM3 的分析  94-97
  4、结论  97-98
第七章全文总结  98-100
参考文献  100-118
致谢  118-119
作者简介  119

相似论文

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
© 2012 www.xueweilunwen.com