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荷载紫杉醇药物的普朗尼克（F127）/聚乙烯亚胺（PEI）多功能胶束的构建及其体内外评价

作　者: 王金丽
导　师: 李凌冰
学　校: 山东大学
专　业: 药剂学
关键词: F127-PEI共聚物 F127-FOL共聚物混合胶束体外释放细胞毒性组织分布
分类号: R94
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

紫杉醇(paclitaxel,PTX,商品名Taxol)是从红豆杉属植物中分离提取的一种含有紫杉烷结构的抗癌药,具有微管稳定作用,进而抑制细胞有丝分裂,诱导细胞凋亡,是一种高效的细胞毒类药物。紫杉醇于1992年12月通过了美国国家食品与药品管理中心的批准,成为晚期卵巢癌的治疗药物,随后又批准用于治疗乳腺癌。目前,紫杉醇已成功地应用于乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤在内的多种恶性肿瘤的治疗,成为世界抗癌首选药物。紫杉醇的理化性质表明,其在水中溶解度约0.25μg/ml,在正辛醇中易溶,脂溶性强,因此增加紫杉醇溶液度成为其广泛应用的限制因素之一。临床应用的主要是紫杉醇注射液,即由乳浮EL(Cremophor EL,含聚氧乙烯蓖麻油)/无水乙醇(50：50)制成的无色薪稠状浓溶液,主要用于卵巢癌和乳腺癌。但是大量研究表明,紫杉醇注射液中的cremop horEL易引起过敏反应、肾毒性、神经毒性、呼吸抑制、嗜睡和低血压,极大地限制了临床应用。由于油针的剂型一直没有在临床上应用,目前在申报的水针剂,多采用脂质体、纳米粒等技术以期解决水溶性低的问题。基于上述原因,为提高其水溶性及靶向性,降低毒副作用,本文以聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)三嵌段共聚物普朗尼克(Pluronic)F127为载体材料,F127浓度在临界胶束浓度(CMC)以上时,在水中会自发形成以聚氧乙烯为亲水外壳,聚氧丙烯为疏水内核的纳米胶束,疏水性药物紫杉醇增溶在疏水性内核部分。因带正电荷的微粒易于靶向肺组织,为提高紫杉醇肺靶向性及克服胶束进入体循环系统被稀释后易于分解现象,以低分子量聚乙烯亚胺为交联剂,采用外壳交联法将普朗尼克F127外壳交联,形成稳定胶束,交联后的胶束在生理条件下带正电荷,不但提高其稀释稳定性,而且提高了其肺靶向性。将叶酸(Folic Acid,FOL)引入嵌段共聚物F127的端基上(F127-FOL),然后与F127-PEI按一定质量比(9：1)组成混合胶束,提高其主动靶向性和稳定性。本课题的研究过程及结果如下：1.采用乳化溶剂蒸发法合成低分子量PEI交联普朗尼克F127共聚物(F127-PEI)。首先利用羰基二咪唑(CDI)活化F127,然后利用低分子量PEI的分枝结构末端丰富的伯氨基,将PEI与活化的F127(Activated-F127)交联起来,从而制得交联化的纳米胶束。根据乳化／溶剂蒸发法的实际制备过程,以载药量和包封率为主要考察指标,以临界胶束浓度(CMC值)为次要考察指标,通过单因素实验考察活化的F127与PEI的质量比、旋转蒸发温度、水相体积、乳化时间等因素的影响,确定制备工艺。根据单因素考察结果,得出最佳处方及工艺为：活化的F127与PEI质量比为25,水相体积为l0mmL,旋转蒸发温度为30℃,乳化时间为3min。叶酸修饰的F127嵌段共聚物的合成：首先利用羰基二咪唑(CDI)活化FOL,然后用活化的FOL与F127末端的羟基反应,即得F127-FOL。合成的载体材料的结构表征,Activated-F127的红外光谱特征峰：1761.54cm-1为咪唑中羰基峰,由此可说明已形成CDI活化的Activated-F127生成。F127-PEI的红外光谱特征峰：3422.43cm-1为NH的伸缩振动吸收峰,1717.16cm-1为羰基峰,由此可表征F127-PEI共聚物的结构。F127-FOL的1H-NMR光谱特征峰：δ：1.03(CH3in PPO of F127),1.1-1.48 (m, CH2CH2CO of folate),3.33(H2O),3.42-3.48(s, CH in PPO of F127),3.50 (s, CH2CH2O of F127),3.6(d,CH2 in PPO of F127),4.5 (d, NCHCO of folate),6.6 (d,3,5-H of benzene ring in folate),7.6 (d,2,6-H of benzene ring in folate),8.6 (s, C7-H in pteridine proton of folate),由此可表征F127-PEI共聚物的结构。通过紫外分光光光度计测得F127-PEI中PEI的含量以及F127-FOL中叶酸的含量,以验证实验中PEI和叶酸的接枝率2.采用薄膜水化法制备荷载紫杉醇(PTX)的F127-PEI (PTX-F127-PEI)共聚物胶束,以载药量、包封率为指标,在单因素实验初选的基础上,采用四因素、五水平的星点设计-效应面优化法进行了PTX胶束处方的优化,获得较优处方为：PTX为2.5mg,水化体积为10mL,水相pH为6.9,旋转蒸发温度为32.5℃。PTX的F127-PEI/F127-FOL共聚物胶束按最优处方进行制备。胶束的理化性质考察结果显示,胶束呈圆球形,大小比较均匀,微有交联,F127胶束,F127-PEI胶束及F127-PEI/F127-FOL混合胶束的粒径分别为19.19nm、56.45nm、68.77nm,表面电荷分别为-9.49、7.67、-5.20mV。3.体外释放结果表明,PTX-F 127-PEI共聚物胶束和PTX-F127-PEI/F127-FOL混合胶束均具有促进释放的作用,聚乙烯亚胺和叶酸中均具有pH响应结构,由PTX共聚物胶束释放结果可知,在同一pH条件下交联胶束的药物释放快于未交联胶束,具有pH敏感性。4.采用MTT比色法研究并比较PTX-F127胶束、PTX-F127-PEI胶束、PTX-F127-PEI/F 127-FOL混合胶束及PTX溶液对HeLa肿瘤细胞体外生长及增值的影响,评价体内外抗肿瘤活性。结果表明,紫杉醇的抗肿瘤活性为：PTX-F127-PEI/F 127-FOL混合胶束>PTX-F127胶束>PTX-F127-PEI胶束>PTX溶液,半数抑制浓度分别为：0.425、1.106、1.776及17.781μg/mL。由于PEI具有较强的渗透作用,能破坏细胞的溶酶体,具有一定的细胞毒性,所以还进行了活化的F127与PEI不同质量比所形成的空白胶束的MTT实验,结果显示,细胞抑制率随着低分子量PEI量的减少而降低,但细胞抑制率均小于6%。远远小于高分子量PEI(25kDa)的毒性。由细胞摄取实验可知,随着时间的延长,细胞的荧光强度呈现先升后降的抛物线性状。三种胶束组在细胞中的蓄积度均高于游离罗丹明B溶液组,叶酸实验组高于非叶酸组和叶酸阴性对照组。5.小鼠静脉注射Taxol注射液、PTX-F127-PEI胶束、PTX-F127-PEI/F127-FOL混合胶束后,小鼠血药浓度测定结果用DAS2.0药代动力学程序进行处理,三种制剂均符合双室模型特征,药物动力学方程分别为C=1.449e-5.076t+0.438e-147t, C=60.960e-14.447t+0.736e-0.032t, C=1.449e-2.342t+0.273e-0.022t。通过对三种制剂进行药动学参数比较可知,PTX-F 127-PEI胶束与PTX-F127-PEI/F127-FOL昆合胶束的AUC值[13.380(mgL)*h,5.868(mgL)*h]和t1/2β(21.444,31.135h)明显高于Taxol注射液组的AUC值(2.767(mg/L)h]和t1/2β(4.963h)；PTX-F127-PEI胶束组与PTX.F127-PEI/F127-FOL混合胶束的机体清除率CL(0.095L/h/kg和0.415L/h/kg)小于Taxol注射液组机体清除率CL(0.792L/h/kg；与Taxol注射液的平均滞留时间MRT(2.533h)相比,PTX-F127-PEI胶束的MRT延长至9.404h,PTX.F 127.PEI/F127-FOL混合胶束的MRT延长至9.586h。证明两组胶束制剂可显著延长药物在体内的存留时间,具有缓释长效的作用。6.小鼠组织分布试验表明,与Taxol注射液相比,PTX-F127-PEI胶束组和PTX-F127-PEI/F127-FOL混合胶束组使药物在小鼠体内各组织器官的分布发生明显的变化。两胶束组肺内的总靶向效率(Te)均高于注射液组,相对摄取率r分别为3.687和3.119,浓度提高到4.256倍和3.720倍,其中PTX-F127-PEI/F127-FOL混合胶束的总靶向效率高于PTX-F127-PEI胶束,而相对摄取率和峰浓度比小于PTX-F127-PEI胶束,具有明显的肺靶向作用；PTX-F127-PEI胶束的血浆相对摄取率re为8.879,PTX.F127-PEI/F127-FOL混合胶束的相对摄取率r。为2.742,而两组胶束制剂在肝、脾、肾的峰浓度比Ce均小于1。表明胶束制剂组能改变药物在组织器官的分布,具有显著的肺靶向性分布。

全文目录

摘要  12-16
ABSTRACT  16-21
符号说明  21-23
前言  23-27
第一部分 F127-PEI与F127-FOL共聚物载体材料的合成及结构表证  27-38
  一、材料与仪器  27-28
    1.材料  27
    2.仪器  27-28
  二、实验方法与结果  28-37
    1.F127-PEI共聚物的制备  28-35
      1.1 Activated-F127的合成及结构表征  28-29
      1.2 F127-PEI的合成与表征  29-30
      1.3 F127-PEI共聚物制备工艺的考察  30-35
      1.4 F127-PEI胶束中PEI的测量  35
    2. 叶酸修饰的普朗尼克F127共聚物(F127-FOL)的合成及结构表征  35-37
      2.1 F127-FOL的合成  35-36
      2.2 F127-FOL中FOL的含量测定  36
      2.3 F127-FOL的~1H-NMR光谱测定  36-37
  三、讨论  37-38
第二部分荷载紫杉醇药物的普朗尼克(F127)/聚乙烯亚胺(PEI)多功能胶束的制备及理化性质考察  38-56
  一、材料与仪器  38-39
    1.材料  38
    2.仪器  38-39
  二、试验方法与结果  39-55
    1 HPLC法测定载药胶束中紫杉醇含量的方法的建立  39-44
      1.1 检测波长的确定  39-40
      1.2 色谱条件与系统适应性实验  40-42
      1.3 标准曲线的绘制  42
      1.4 精密度与回收率试验  42-44
    2. 载药量与包封率的测定  44
    3.制备方法的选择  44-52
      3.1 乳化溶剂蒸发法  44
      3.2 薄膜水化法  44-45
      3.3 透析法  45
      3.4 PTX载药共聚物胶束制备工艺的考察  45-49
      3.5 星点设-效应面优化法优化处方  49-52
    4.F127-PEI/F127-FOL混合载药胶束的制备  52
    5.胶束形态的观察  52-53
    6.胶束束结构纳米粒粒径及其分布的测定  53-55
    7.纳米粒的表面电位测定  55
  三、讨论  55-56
第三部分荷载紫杉醇药物的普朗尼克(F127)/聚乙烯亚胺(PEI)多功能胶束的体外药物释放  56-64
  一、实验仪器及试剂  56
    1.材料  56
    2.仪器  56
  二、试验方法与结果  56-62
    1.HPLC法测定载药胶束体外释放度方法的建立  56-58
      1.1 色谱条件  57
      1.2 体外释放度测定的标准曲线  57-58
    2.溶液的配制  58
    3.紫杉醇在不同pH的水杨酸钠溶液中的稳定性考察  58-59
    4.载药胶束的体外释放试验  59-60
    5.紫杉醇胶束的体外释放结果  60-62
      5.1 紫杉醇在1M的水样酸钠溶液中的释放  60
      5.2 紫杉醇共聚物胶束在不同pH水杨酸钠中的释放  60-62
  三、讨论  62-64
第四部分荷载紫杉醇药物的普朗尼克(F127)/聚乙烯亚胺(PEI)多功能胶束抗肿瘤活性评价  64-72
  一、实验材料与仪器  64
    1.材料  64
    2.仪器  64
  二、实验方法与结果  64-71
    1.细胞的培养  64-66
      1.1 Hela细胞的复苏  65
      1.2 贴壁细胞的消化、培养  65
      1.3 细胞计数  65-66
      1.4 细胞冻存  66
    2.空白胶束的细胞毒性试验  66-67
    3.载药胶束的抗肿瘤试验  67-69
    4.罗丹明B胶束的细胞摄取实验  69-71
  三、讨论  71-72
第五部分荷载紫杉醇药物的普朗尼克(F127)/聚乙烯亚胺(PEI)多功能胶束给药系统的体内药动学及组织分布研究  72-95
  一、材料、仪器与动物  72-73
    1.材料  72
    2.仪器  72-73
    3.动物  73
  二、方法与结果  73-92
    1.PTX组织样品高效液相色谱分析方法的建立  73-79
      1.1 色谱条件  73
      1.2 样品处理  73
      1.3 方法专属性试验  73-76
      1.4 最低检测限  76
      1.5 组织样品标准工作曲线的制备  76-77
      1.6 精密度、回收率测定  77-79
    2.小鼠体内药物动力学及组织分布试验  79-92
      2.1 小鼠体内动力学及组织分布试验方案  79-80
      2.2 小鼠体内药物动力学研究结果  80-83
      2.3 小鼠体内分布试验结果  83-92
  三、讨论  92-95
全文结论  95-98
参考文献  98-106
致谢  106-107
攻读硕士学位期间发表的学术论文目录  107-108
学位论文评阅及答辩情况表  108

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