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我国葡萄根瘤蚜遗传分化研究及翅型分化相关基因的筛选

作　者: 孙庆华
导　师: 翟衡
学　校: 山东农业大学
专　业: 葡萄与葡萄酒学
关键词: 葡萄根瘤蚜生物型 mtDNA COⅠ 遗传多样性翅型分化
分类号: S436.631
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch)是葡萄栽培上的毁灭性害虫。2005年我国再次发现了葡萄根瘤蚜,这对我国葡萄产业构成了巨大威胁。为了及时、有效的防治根瘤蚜,必须深入研究我国根瘤蚜的生物学、生态学和遗传特性。为此本文对我国根瘤蚜生物型进行了鉴定,对不同地理种群根瘤蚜的遗传多样性与系统发育进行了初步探讨,并对根瘤蚜翅型分化相关基因进行了筛选。主要结果如下:1.我国葡萄根瘤蚜生物型鉴定分析采用离体根鉴定系统对我国的6个葡萄根瘤蚜克隆的侵染能力进行了鉴定分析,结果表明:1)根瘤蚜在抗性砧木SO4、5BB、101-14M上均不能够发育为成虫,滞育在1龄。2)在敏感品种赤霞珠上,SH Kyoho克隆的成虫存活率最高,而HN Kyoho和LN Beta克隆的存活率较低。但各个克隆的日产卵量和生命表参数没有明显差异。3)综合根瘤蚜在赤霞珠、刺葡萄、贝达和140Ru上的表现,发现SH Kyoho克隆的Ro最大,rm和λ最高,DT最短,说明SH Kyoho克隆侵染能力较强。2.我国根瘤蚜mtDNACOⅠ的遗传多样性与系统进化分析通过线粒体DNACOⅠ多态性研究了我国葡萄根瘤蚜的遗传分化与系统发育,并将我国根瘤蚜单倍型与GenBank中已发表的83个单倍型进行了聚类分析。结果表明:1)序列中A、C、T、G四种核苷酸的比例分别为34.8%、15.8%、39.2%和10.2%,富含A+T;29个变异位点中单一多态位点12个,简约信息位点17个。2)在我国根瘤蚜群体中共确定了13种单倍型,其中上海群体单倍型相对丰富,且上海根瘤蚜种群与其它三个种群之间没有共享单倍型。3)上海群体与陕西、湖南和辽宁三个种群的遗传距离较大(0.039～0.040),Nm最小(0.02),在分子系统发育树和单倍型网络图上为独立分支,说明我国根瘤蚜至少有两个独立的来源。3.我国葡萄根瘤蚜不同地理种群的遗传多样性分析应用7对SSR引物对4个葡萄根瘤蚜根瘤蚜地理种群进行了遗传多样性分析。1)PIC信息指数显示除Dvit4在上海群体和陕西群体表现出高度多态之外,其他位点在所有种群中均表现为中度多态或低度多态。2)4个种群观察杂合度普遍高于期望杂合度,期望杂合度较低(0.3564～0.3730),Shannon指数的平均数都小于1.0,说明群体内遗传变异性较小,遗传多样性较差,其中上海群体的遗传多样性相对丰富。3)对4个根瘤蚜种群的遗传分化进行分析,发现83%的遗传分化多样性驻留在群体内。4)上海群体与其它群体的遗传距离较大(0.4531～0.4694),其它三个群体之间的遗传距离差别较小(0.0028～0.0114),其中湖南与辽宁群体之间的遗传距离最小,仅为0.0028。以Nei氏遗传距离进行UPGMA聚类分析获得的结果表明:4个种群明显分为两支,上海种群为独立分支,其它三个种群聚为一支,其中湖南和辽宁两大种群遗传关系较近,这与mtDNACOⅠ的结果一致。4.抑制消减杂交(SSH)筛选翅型分化基因以翅型分化关键期的无翅2龄和有翅2龄若蚜为试材,运用SSH技术对葡萄根瘤蚜的翅型分化机制进行了研究。从有翅蚜文库中筛选到51个特异基因片段,其中有17条ESTs为已知序列,它们代表14种基因,其它34条为功能未知的基因或检索不到匹配序列的新基因。14种ESTs功能已知按其功能可分为4类:细胞组成、物质代谢、转录因子、逆转座子。无翅文库中得到44个差异表达的ESTs序列,其中12个已知基因,8个未知功能的基因和24个与其它物种同源性较低或找不到同源性的ESTs。5.翅型分化相关基因的荧光定量PCR分析从有翅和无翅根瘤蚜特异表达的已知ESTs中挑选13个基因,用荧光定量PCR技术检测其在各龄期有翅蚜中的表达模式,结果表明:Brat、Apyrase、CHD和RPS 15a基因在翅型分化的关键期(有翅2龄)高表达,与无翅2龄相比达到了极显著水平,且随有翅蚜龄期的增长其表达量逐渐下降,说明这四个基因在翅型分化过程中可能起着关键作用。

全文目录

中文摘要  10-12
Abstract  12-14
1 前言  14-35
  1.1 葡萄根瘤蚜的危害及生活史  14-16
  1.2 葡萄根瘤蚜的形态特征  16
  1.3 葡萄根瘤蚜生物型研究进展  16-21
    1.3.1 美国根瘤蚜生物型  17-18
    1.3.2 欧洲根瘤蚜生物型  18-19
    1.3.3 生物型的鉴定方法  19-21
  1.4 葡萄根瘤蚜的群体遗传多样性研究进展  21-23
    1.4.1 地理环境与起源  21-22
    1.4.2 寄主与协同进化  22-23
    1.4.3 有性繁殖或突变  23
  1.5 蚜虫遗传多样性研究常用的分子标记  23-27
    1.5.1 RAPD  24-25
    1.5.2 AFLP  25
    1.5.3 SSR  25-27
  1.6 葡萄根瘤蚜的系统地理发生研究进展  27-28
  1.7 蚜虫翅型分化研究进展  28-33
    1.7.1 影响翅型分化的因素  29-31
    1.7.2 翅多型的遗传机制  31-33
  1.8 本研究的目的及意义  33-34
  1.9 技术路线  34-35
2 材料与方法  35-57
  2.1 葡萄根瘤蚜的生物型鉴定  35-36
  2.2 葡萄根瘤蚜mtDNACOⅠ遗传分化与系统发育  36-39
  2.3 不同地理种群葡萄根瘤蚜的SSR 分析  39-44
  2.4 抑制消减杂交筛选翅型分化相关基因  44-53
  2.5 荧光定量PCR 检测翅型分化基因在有翅蚜中的表达模式  53-57
3 结果分析  57-91
  3.1 我国葡萄根瘤蚜的生物型鉴定  57-62
    3.1.1 不同来源的根瘤蚜克隆在不同葡萄品种上的存活率比较  57-59
    3.1.2 不同来源的根瘤蚜克隆在不同葡萄品种上的日产卵量比较  59-60
    3.1.3 不同来源的根瘤蚜克隆在不同葡萄品种上的生命表参数比较  60-62
  3.2 我国葡萄根瘤蚜mtDNACOⅠ遗传分化与系统发育  62-68
    3.2.1 DNA 提取及PCR 扩增结果  62
    3.2.2 葡萄根瘤蚜mtDNACOⅠ序列长度与碱基组成  62-63
    3.2.3 4个葡萄根瘤蚜群体线粒体COⅠ的遗传结构分析  63-65
    3.2.4 葡萄根瘤蚜线粒体COⅠ序列的单倍型网络关系  65-66
    3.2.5 葡萄根瘤蚜群体的系统发生关系  66-68
  3.3 我国葡萄根瘤蚜的遗传多样性研究  68-75
    3.3.1 基因组DNA 提取结果  68
    3.3.2 PCR 扩增结果  68-69
    3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果  69
    3.3.4 多态信息含量  69-70
    3.3.5 杂合度  70-71
    3.3.6 观测等位基因数和有效等位基因数  71
    3.3.7 Shannon 指数  71-72
    3.3.8 中性测试  72-73
    3.3.9 各个位点的F 统计值  73-74
    3.3.10 遗传距离  74-75
  3.4 抑制性消减杂交筛选葡萄根瘤蚜翅型分化相关基因  75-91
    3.4.1 葡萄根瘤蚜总RNA 的提取结果  75-76
    3.4.2 RNA 纯化结果  76-77
    3.4.3 双链cDNA 的合成结果  77
    3.4.4 Rsa I 酶切质检结果  77-78
    3.4.5 接头验证结果  78
    3.4.6 差减验证结果  78-79
    3.4.7 斑点杂交结果  79-85
    3.4.8 荧光定量PCR 检测翅型分化基因在有翅蚜中的表达模式  85-91
4 讨论  91-100
  4.1 我国葡萄根瘤蚜生物型分析  91-92
  4.2 我国葡萄根瘤蚜mtDNACOI 遗传分化与系统发育分析  92-93
  4.3 不同地理种群葡萄根瘤蚜的遗传多样性分析  93-95
  4.4 抑制消减杂交技术在翅型分化研究中的利用  95-96
  4.5 葡萄根瘤蚜翅型分化相关基因分析  96-100
5 结论  100-102
参考文献  102-112
附图1  112-113
附表1  113-131
发表论文  131-132
致谢  132

我国葡萄根瘤蚜遗传分化研究及翅型分化相关基因的筛选

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