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褐飞虱翅型分化内分泌机理研究

作　者: 刘淑华
导　师: 刘泽文
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 褐飞虱翅型分化内分泌机理保幼激素酯酶法尼酸-O-甲基转移酶 CYP303A1
分类号: S435.112.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

褐飞虱Nilaparvata lugens (Stal)是水稻的主要害虫,其成虫具有明显的翅二型现象,即能作长距离飞行的长翅型和无飞行能力的短翅型。褐飞虱翅型的分化受多种因子的影响,虽然目前机理还不是很明确,但激素调控机理得到广泛认同,即各种因子通过调节保幼激素(Juvenile hormone, JH)的滴度来控制翅型。为了更好的对褐飞虱进行监测与治理,从而控制其迁飞与危害,本文用分子生物学方法克隆出保幼激素酯酶(JHE)、法尼酸-O-甲基转移酶(FAMeT)和保幼激素环氧化酶(CYP303A1)几个关键的JH分解与合成酶基因,分析了各基因在长、短翅品系中的发育表达差异,在褐飞虱翅型分化的内分泌机制方面取得了一定的进展。一、褐飞虱保幼激素酯酶基因的克隆与分析采用简并引物PCR和RACE技术克隆了褐飞虱JHE的全长基因(NlJHE),这是首个在半翅目昆虫中克隆出的JHE基因。NlJHE的氨基酸序列含有其他昆虫JHEs的五个功能保守区。NlJHE与芜菁叶蜂(Athalia rosae)和意大利蜜蜂(Apis mellifera)的JHE有很高的相似性,分别为40%和39%。在杆状病毒表达系统中分离的重组NlJHE蛋白具有较高的分解JHⅢ的活性,且特征常数(kcat/KM=4.28×106M-1s-1)和其他已经验证的昆虫JHE很接近,因此,NlJHE cDNA编码一种功能性JHE。NlJHE主要在脂肪体中表达,在五龄若虫48h达到最高值。在五龄初期及孵化后48h,长翅个体的NlJHE mRNA水平和JHE活性都显著高于短翅个体,且JHⅢ水平较低。这些数据表明NlJHE可能在JH水平调节及翅型分化中起很重要的作用。二、褐飞虱保幼激素法尼酸-O-甲基转移酶基因的克隆与分析法尼酸-O-甲基转移酶(FAMeT)是JH合成过程中一个关键的酶,催化法尼酸(FA)到甲基法尼酯(MF)的甲基化。本文采用简并引物PCR和RACE技术克隆了褐飞虱FAMeT的全长基因(NlFAMeT),该基因编码299个氨基酸残基。NlFAMeT与其他昆虫的FAMeTs有很高的相似性(52-54%)。NlFAMeT主要在咽侧体和大脑(不包括咽侧体)中高量表达,在卵巢中也检测到有低量表达。发育表达检测发现,NlFAMeT的表达量与保幼激素滴度不存在相关性,说明NlFAMeT可能与褐飞虱JH的合成无关。在卵巢中也检测到有NlFAMeT的低量表达。NlFAMeT与雌性成虫卵黄蛋白的发育有正相关性。这些数据表明NlFAMeT可能不是JH合成过程中关键的酶类,但是在卵巢发育过程中起到很关键的调节作用。三、褐飞虱保幼激素环氧酶基因的克隆与分析在褐飞虱体内成功克隆了一个新的细胞色素P450基因CYP303A1的全长序列。CYP303A1基因可编码497个氨基酸残基,并和其他昆虫的P450 CYP303A1s有很高的一致性,其蛋白质序列含有一个典型微粒体P450的所有特征。CYP303A1可催化甲基法尼酯(MF)向JHⅢ的转变,主要在褐飞虱的咽侧体内表达。褐飞虱的3-4龄若虫期是翅型分化的关键期,在此期间,短翅个体的CYP303A1的转录水平及JH滴度都明显高于长翅个体。这些数据表明CYP303A1可能是调节褐飞虱JH滴度进而影响其翅型分化的一个关键因子。JH滴度是昆虫翅型分化的关键因子,本文率先克隆了首个半翅目昆虫的JHE基因和一个新的细胞色素P450基因。首次以JH合成与分解关键酶为切入点,测定了几种关键酶在褐飞虱长、短翅品系中的发育表达差异,较为系统的分析了褐飞虱翅型分化的内分泌机理。本研究结果可推动昆虫翅型分化内在机制的研究进展,从而为害虫的监测与防治提供一定的理论基础,同时为昆虫的生理学研究提供一定的帮助。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
前言  11-12
第一章文献综述  12-26
  1 昆虫翅型分化机理研究进展  12-16
    1.1 影响昆虫翅型分化的环境因子  13-14
    1.2 昆虫翅型分化的遗传机理  14-16
  2 昆虫翅型分化的内分泌机理研究进展  16-24
    2.1 JH滴度在长(有)、短(无)翅个体间差异显著  22
    2.2 JH(蜕皮激素,EC)及其类似物对翅型分化的影响  22-23
    2.3 保幼激素酯酶与翅型分化关系  23-24
  3 褐飞虱翅型分化现象与内分泌机理  24-26
第二章褐飞虱保幼激素酯酶基因的克隆与性质分析  26-46
  1 材料与方法  27-36
    1.1 试验用虫  27
    1.2 主要试剂  27-28
    1.3 总RNA提取及cDNA模板合成  28-29
    1.4 PCR引物设计  29-31
    1.5 褐飞虱JHE基因的克隆  31-34
    1.6 实时定量PCR(qRT-PCR)  34
    1.7 JH滴度测定  34-35
    1.8 JHE活性测定及JH Ⅲ处理  35
    1.9 重组NlJHE的杆状病毒体外表达  35-36
  2 结果与分析  36-43
    2.1 褐飞虱保幼激素酯酶基因的克隆结果与分析  36-40
    2.2 NlJHE mRNA的组织和发育表达水平  40
    2.3 用杆状病毒表达系统对NlJHE蛋白进行体外表达  40-41
    2.4 长、短翅五龄个体间NlJHE表达水平差异  41
    2.5 JH Ⅲ点滴试验对NlJHE表达的影响  41-43
  3 讨论  43-46
第三章褐飞虱保幼激素法尼酸-O-甲基转移酶基因的克隆与定量分析  46-58
  1 材料与方法  47-49
    1.1 试验材料  47
    1.2 PCR引物设计  47-48
    1.3 褐飞虱FAMeT基因的克隆  48-49
    1.4 实时定量PCR(qRT-PCR)  49
    1.5 JH滴度测定  49
  2 结果与分析  49-55
    2.1 褐飞虱FAMeT基因的克隆结果与分析  49-52
    2.2 NlFAMeT mRNA的组织表达水平  52-53
    2.3 褐飞虱头部NlFAMeT mRNA的发育表达水平  53
    2.4 五龄若虫期NlFAMeT mRNA水平和JH滴度  53-54
    2.5 NlFAMeT mRNA在卵巢不同的发育阶段的含量变化  54-55
  3 讨论  55-58
第四章褐飞虱保幼激素环氧酶基因CYP303A1的克隆与定量分析  58-68
  1.材料与方法  59-61
    1.1 试虫  59
    1.2 PCR引物设计  59
    1.3 褐飞虱细胞色素P450酶(CYP303A1)基因的克隆  59-60
    1.4 褐飞虱CYP303A1基因的组织表达分析  60
    1.5 褐飞虱CYP303A1基因的发育表达分析  60-61
    1.6 JH滴度测定  61
  2 结果与分析  61-65
    2.1.CYP303A1 cDNA全长序列的克隆  61-63
    2.2 CYP303A1基因的组织表达分析  63
    2.3 褐飞虱CYP303A1基因的发育表达  63-65
  3 讨论  65-68
全文总结  68-70
参考文献  70-78
附录:发表的学术论文  78-80
致谢  80

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