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人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析研究

作　者: 王士珍
导　师: 陈永珍
学　校: 苏州大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 人胚胎生殖细胞抗坏血酸 cTnT 质谱色谱
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:1.建立以人胚胎成纤维细胞为饲养层体外培养、扩增人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells, hEGCs,人EG细胞)的方法。2.利用抗坏血酸诱导人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化;3.探讨人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化过程中蛋白质表达谱的改变。方法:取5-10周人胚胎生殖腺嵴,组织块培养法原代培养人EG细胞;取同一胚胎来源的人胚胎成纤维细胞作饲养层,传代培养人EG细胞。将生长良好的人EG细胞,接种于细菌培养皿中进行悬浮培养,7天后将形成的拟胚体置于明胶包被的24孔培养板中,加入含0.1mg/ml抗坏血酸的诱导液进行诱导分化培养,用免疫荧光法检测诱导2周后细胞中心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达。分别提取人EG细胞和诱导2周后细胞的蛋白质,采用iTRAQ试剂对蛋白样品进行差异标记(114标记诱导细胞蛋白组、115标记人EG细胞蛋白组)、液相色谱(LC)分离这2组样品的总蛋白、串联质谱(MS/MS)鉴定人EG细胞和诱导后细胞差异表达的蛋白。结果:体外培养的人胚胎成纤维细胞呈长梭形,生长状态良好。以同源人胚胎成纤维细胞为饲养层传代培养的人EG细胞增殖旺盛,其集落呈典型的“鸟巢状”,和原代培养形成的克隆大小无明显区别,目前已传到第6代。人EG细胞经抗坏血酸诱导2周后,阳性表达cTnT,细胞呈多边形。质谱分析共鉴定出349种蛋白(蛋白置信度>95%),其中27种蛋白(21种上调蛋白、6种下调蛋白)在人EG细胞和诱导后细胞中差异显著(差异倍数>3)。结论:初步建立了以人胚胎成纤维细胞为饲养层体外扩增人EG细胞的培养方法。人EG细胞在抗坏血酸的诱导下分化为心肌细胞。质谱分析方法可高通量筛选与人EG细胞向心肌细胞分化相关的重要蛋白。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-8
引言  8-12
第一部分人胚胎生殖细胞体外培养体系的方法学研究  12-23
  材料与方法  12-15
  结果  15-17
  附图  17-20
  讨论  20-23
第二部分人胚胎生殖细胞诱导分化为心肌细胞的研究  23-34
  材料与方法  23-26
  结果  26-28
  附图  28-31
  讨论  31-34
结论  34-35
参考文献  35-40
综述  40-49
  参考文献  47-49
攻读学位期间发表的论文  49-50
缩略词表  50-51
致谢  51-52

人胚胎生殖细胞向心肌细胞诱导分化及质谱分析研究

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