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猪细管冷冻精液技术研究

作　者: 张渭斌
导　师: 孙世铎
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪冷冻精液 0.5mL细管受胎率
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

限制猪冷冻精液推广的主要原因是其冷冻解冻后受胎率较低,国内外关于猪冷冻精液的报道很多,选择的切入点也不尽相同,我们对部分添加剂及冷冻解冻程序进行了研究。本试验以0.5mL细管为基础,在冷冻保护液方面,研究了在冷冻保护液添加维生素E、咖啡因对冷冻解冻精子的影响,试验结果以精子运动性、质膜完整率、顶体完整率等指标进行评定。同时对冻冷冻解冻程序进行优化,最后进行了0.5mL细管冷冻精液受胎率试验。得到如下结果:1.咖啡因对猪精子在冷冻过程中有明显的保护作用,冷冻保存液中添加0.2 mg/mL的咖啡因能显著提高猪精液解冻后精子的活力。2.维生素E的抗氧化作用在猪冷冻精液中效果明显,通过降低脂质过氧化反应,可有效减少过量的ROS对精子造成的损伤,添加浓度为400μM时效果最佳,可以显著提高精子的活力、顶体完整率和质膜完整率。3.确定了适合程序冷冻仪的冷冻程序,最佳的冷冻曲线为:以2℃/min从+5℃将至-5℃,-5℃保持1min,随后以60℃/min将至-140℃,平衡10min后迅速转入液氮中;以不同降温速度通过低温危险区时对解冻后精子的品质影响差异不明显;0.5mL细管采用38℃水浴解冻30s或者50℃水浴13s解冻,50℃解冻时需要把握准确的解冻时间;4. 0.5mL细管冷冻精液输精结果显示鲜精人工输精效果优于冷冻精液。冷冻精液的妊娠率达到72%,产仔数为6.64±0.82头。常规输精法时用60mL和80mL稀释液体积对产仔率、产仔数没有明显的影响。冷冻精液通过子宫内人工输精的最佳精子数为2×10~9个,稀释液体积为60mL。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-28
  1. 试验目的及意义  11-12
  2. 猪冷冻精液保存的研究进展  12-14
  3. 猪精液冷冻机理  14-15
  4. 影响猪冷冻精液冷冻效果的因素  15-22
    4.1 猪精液和精子的基本特点  16-17
    4.2 冷冻稀释液  17-21
      4.2.1 糖类  17
      4.2.2 卵黄  17-18
      4.2.3 冷冻保护剂  18-19
      4.2.4 冷冻添加剂  19-20
      4.2.5 冷冻剂型  20-21
    4.3 稀释方法  21
    4.4 精液的冷冻方法  21-22
    4.5 解冻方法  22
  5. 解冻后精液品质的检测  22-26
    5.1 精子活率  22-23
    5.2 精子活力  23
    5.3 精子质膜完整性  23-24
    5.4 获能检测和精子顶体完整性检测  24-25
      5.4.1 透射电镜法  24
      5.4.2 染色方法  24-25
    5.5 线粒体功能检测  25
    5.6 透明带结合检测  25
    5.6 卵母细胞穿透检测和体外受精检测  25-26
      5.6.1 穿卵试验  26
      5.6.2 体外受精  26
      5.6.3 精子DNA 完整性的检测  26
  6. 人工授精  26-27
  7. 存在问题与应用前景  27-28
第二章细管冷冻精液保存技术试验研究  28-49
  试验一咖啡因对猪精液冷冻的影响  28-31
    1 材料与方法  28-30
      1.1 猪精液来源  28
      1.2 试验主要仪器  28
      1.3 稀释液的配制  28-29
      1.4 精液的稀释与平衡  29
      1.5 冷冻和解冻程序  29
      1.6 冻精的评估  29
        1.6.1 活力  29
        1.6.2 顶体完整率  29
        1.6.3 质膜完整率  29
      1.7 试验设计  29-30
      1.8 数据处理  30
    2 结果与分析  30
      2.1 不同浓度咖啡因对猪精液冷冻解冻后精子的影响  30
      2.2 三种方案冷冻保护效果比较  30
    3 讨论  30-31
  试验二维生素E 对猪精液冷冻的影响  31-35
    1 材料与方法  31-32
      1.1 试验动物及精液收集  31
      1.2 冷冻精液的制作  31-32
      1.3 冷冻精液解冻  32
      1.4 冻精的评估  32
        1.4.1 活力  32
        1.4.2 顶体完整率  32
        1.4.3 质膜完整率  32
      1.5 数据处理  32
    2 结果  32-35
      2.1 不同维生素E 添加量对解冻后运动性的影响  32-33
      2.2 不同维生素E 添加量对解冻后顶体完整率的影响  33-35
    3 讨论  35
    4 小结  35
  试验三冷冻解冻程序的优化  35-41
    1 材料与方法  36-38
      1.1 试验动物及精液收集  36
      1.2 试验主要仪器  36
      1.3 试验用主要试剂  36
      1.4 冷冻精液制作  36-37
      1.5 冷冻精液解冻  37
      1.6 精子质量评估  37-38
        1.6.1 活力  37
        1.6.2 顶体完整率  37-38
        1.6.3 质膜完整率  38
      1.7 数据处理  38
    2 结果  38-39
      2.1 三种冷冻曲线对猪精子解冻后的影响（0.5m L 细管冻精）  38
      2.2 不同冷冻速度通过危险区对解冻后精子的影响（0.5m L 细管冻精）  38-39
      2.3 两种甘油浓度和解冻速度对解冻后精子的影响（0.5m L 细管冻精）  39
      2.4 冻精细管类型对解冻后精子的影响  39
    3 讨论  39-40
    4 结论  40-41
  试验四猪0.5ML 细管冷冻精液人工输精试验研究  41-49
    1 材料与方法  41-44
      1.1 新鲜精液的准备  41
      1.2 冷却稀释液的配制  41-42
      1.3 冷冻精液的制作  42
      1.4 冷冻精液的解冻及冻精的评估  42-43
        1.4.1 活力  42
        1.4.2 顶体完整率  42-43
        1.4.3 质膜完整率  43
      1.5 试验母畜  43
      1.6 发情鉴定  43
      1.7 人工授精  43
      1.8 收集数据  43-44
      1.9 数据处理  44
    2 结果与分析  44-46
      2.1 自制细管冷冻精液解冻后指标  44
      2.2 人工输精试验结果及分析  44-46
    3 讨论  46-47
    4 结论  47-49
参考文献  49-53
附录  53-60
致谢  60-61
作者简介  61

猪细管冷冻精液技术研究

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