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植物OPR基因家族系统发育分析及水稻OPR家族基因分子生物学功能研究

作　者: 李文燕
导　师: 王金发
学　校: 中山大学
专　业: 遗传学
关键词: OPR 基因家族系统发育结构进化功能分化水稻(Oryza sativa) 表达模式功能分析
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

茉莉酸是植物体内广泛存在的一种植物激素,由亚麻酸经十八烷碳烯酸代谢途径合成的;它不仅作为内源生长物质,在植物的整个发育进程中起调节作用,而且还作为局部和系统的信号分子参与生物和非生物逆境胁迫的应答。12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸生物合成即十八烷碳烯酸代谢途径中的一个关键酶,控制茉莉酸合成的最后步骤。在植物基因组中,OPR属于OYE家族,是黄素单核苷酸依赖的氧化还原酶,并且以多基因家族形式存在。目前,尽管对拟南芥及其他物种的少数几个OPR基因在生化和遗传方面进行研究并取得了一些重要结果,但是对于整个植物OPR基因家族的进化及生物学功能(生化和生理功能)并不很清楚。基于此,本研究在水稻第6染色体S5区基因注释和研究基础上,采取比较基因组学与现代分子生物学实验技术相结合的研究策略,首先从整体层面上对植物OPR基因家族进行系统发育分析,以探究植物OPR基因家族的起源、进化及潜在的功能分化;其次在植物OPR基因家族系统发育分析基础上,从局部层面上对水稻OPR家族基因进行分子生物学研究,以探究水稻OPR家族基因的蛋白结构、生化特性及可能的生理功能。1)在植物OPR基因家族系统发育方面:本研究采用综合生物信息学和系统发育的研究方法进行比较基因组学研究,以探究植物OPR基因家族的系统发育、结构进化及可能的功能分化,取得了以下结果:①利用公共数据库资源,在植物基因组中鉴定了105个OPR基因;其中,在6个不同谱系的11个代表性物种(藻类:莱茵衣藻和团藻;苔藓:小立碗藓;蕨类:卷柏;裸子植物:云杉;单子叶植物:水稻、玉米和高粱;双子叶植物:拟南芥、杨树和苜蓿)中鉴定了74个OPR基因,均以多基因家族形式存在。②通过系统发育分析发现,在植物基因组中,存在7个保守的OPR亚家族;其中,在水生植物中,仅存在一个OPR亚家族即sub.Ⅶ;而在陆生植物中,则存在六个OPR亚家族即subs.Ⅰ～Ⅵ。进一步分析提示,在水生和陆生植物分化后,谱系特异扩增尤其是串联重复是陆生植物OPR基因家族扩增与进化的主要机制,并导致多个OPR亚家族的产生。③通过exon-intron结构分析表明,不同谱系物种中的OPR基因内含子的数目和长度呈现多样性,而内含子的位置和相位却十分保守;这一研究结果并结合系统发育分析提示,在OPR家族基因结构进化过程中,不同谱系间及同一谱内的OPR基因发生持续内含子丢失,从而导致OPR基因结构的多样性。基于上述研究结果,提出了一个关于OPR家族基因结构演化的模型。④通过功能分化分析揭示,在进化过程中,由于受到局部正选择作用,不同OPR亚家族及其成员间发生了功能分化,并且导致功能分化的关键氨基酸位点主要分布于OPR蛋白三维结构的外侧,即α螺旋和底物结合区。2)在OsOPR家族基因分子生物学功能方面:本研究在植物OPR基因家族系统发育分析基础上,选择分别代表五个不同OPR亚家族的OsOPR基因即OsOPR04-1 (sub.Ⅰ)、OsOPR08-1 (sub.Ⅱ)、OsOPR06-1 (sub.Ⅲ)、OsOPR01-1 (sub.Ⅳ)和OsOPR02-1 (sub.Ⅴ),采取同源建模、原核表达、半定量RT-PCR及转基因方法研究水稻不同OPR亚家族基因的蛋白结构、生化及生理功能,取得了以下结果:①通过同源建模及蛋白结构比较分析显示,尽管不同亚家族OPR蛋白的三维结构的基本骨架高度保守即由8个α/β交替排列形成桶状结构,但仍存两个在蛋白三维构象上呈现明显差异的MVRⅰ和ⅱ区;位于MVRⅰ底物结合区决定底物与蛋白的特异结合,而MVRⅱ则影响底物进入由MVRⅰ形成的“口袋”。②通过蛋白体外表达及酶活分析表明,不同亚家族OPR蛋白酶活存在显著差异且呈现明显的底物偏好性;除OsOPR02-1外,其他四个OPR蛋白对反式-2-己烯醛、12-氧-植物二烯酸和顺丁烯二酸均呈现出强或中等程度的催化活性,提示这些亚家族OPR基因可能参与十八烷碳烯酸代谢的两个主要分支HPL和AOS途径,以及能量代谢TCA途径来调节植物的生长发育及防御应答。③通过基因表达谱分析显示,OsOPR家族基因的表达呈现明显的组织特异性且不同程度的响应多种非生物逆境胁迫诱导。OsOPR04-1 (sub.Ⅰ)和OsOPR08-1 (sub.Ⅱ)在各种组织及诱导条件下均呈现较强的表达,提示共存于单、双子叶植物中的subs.Ⅰ和Ⅱ基因可能在植物生长、发育及防御中起重要作用;而OsOPR06-1 (sub.Ⅲ)、OsOPR01-1 (sub.Ⅳ)和OsOPR02-1 (sub.Ⅴ)则在激素诱导下root中的表达明显高于shoot,提示仅存于单子叶植物中的subs.Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ基因可能在根的生长过程中响应激素尤其是ABA和IAA信号起重要作用。④基于上述研究,提出一个关于OsOPR亚家族基因可能的生物学功能模型,从而为进一步通过反向遗传学(基因过表达和基因干涉)的方法深入研究OsOPR家族基因的生物学功能奠定基础。

全文目录

中文摘要  3-6
ABSTRACT  6-10
目录  10-14
第1章文献综述  14-43
  1.1 引言  14
  1.2 植物基因组学研究  14-29
    1.2.1 植物基因组测序进展  15-17
    1.2.2 比较基因组学与分子进化  17-24
      1.2.2.1 基因重复与基因家族  18-20
      1.2.2.2 禾本科植物比较基因组学研究  20-22
      1.2.2.3 分子进化研究  22-24
      1.2.2.4 相关数据库资源  24
    1.2.3 功能基因组学研究  24-29
      1.2.3.1 转录组学研究  25-27
      1.2.3.2 蛋白质组学研究  27-28
      1.2.3.3 植物基因功能研究方法  28-29
  1.3 Oxylipin 信号途径  29-37
    1.3.1 HPL 途径  30-31
    1.3.2 AOS 途径  31-37
      1.3.2.1 JA 的化学本质及生理功能  31-32
      1.3.2.2 JA 的生物合成及调节  32-34
      1.3.2.3 JA 信号的产生及转导  34-36
      1.3.2.4 JA 信号与其他防御途径信号的整合  36-37
  1.4 植物OPR 基因家族的生物学功能研究  37-40
    1.4.1 植物OPR 基因家族的分布及生化特性  38-39
    1.4.2 植物OPR 基因家族的生理功能  39-40
  1.5 本研究的目的、意义及技术路线  40-43
第2章植物OPR 基因家族系统发育分析  43-68
  2.1 引言  43-44
  2.2 材料与方法  44-47
    2.2.1 数据检索与收集  44
    2.2.2 序列比对及系统发育分析  44-45
    2.2.3 基因结构及进化分析  45
    2.2.4 核酸替代模式及正选择分析  45-46
    2.2.5 功能分化分析  46-47
  2.3 结果与分析  47-63
    2.3.1 植物OPR 家族同源基因的鉴定  47-48
    2.3.2 植物OPR 基因家族系统发育分析  48-52
    2.3.3 植物OPR 家族基因结构进化  52-56
    2.3.4 植物OPR 亚家族及成员间正选择分析  56-61
    2.3.5 植物OPR 亚家族及成员间功能分化分析  61-63
  2.4 讨论  63-67
    2.4.1 植物OPR 基因家族的起源与进化  63-64
    2.4.2 植物OPR 基因家族的结构进化  64-65
    2.4.3 植物OPR 基因家族的功能分化  65-67
  2.5 小结  67-68
第3章 OsOPR 家族基因分子生物学功能研究  68-163
  3.1 引言  68-71
  3.2 OsOPR 家族基因蛋白结构及生化功能研究  71-117
    3.2.1 材料与试剂  71-81
      3.2.1.1 菌株与载体  71-72
      3.2.1.2 仪器与试剂  72-81
    3.2.2 实验方法  81-95
      3.2.2.1 蛋白同源建模  81-82
      3.2.2.2 核酸凝胶电泳  82-84
      3.2.2.3 质粒DNA 提取  84-85
      3.2.2.4 目的DNA 片段回收、纯化及与载体连接  85-86
      3.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备、转化及重组子鉴定  86-88
      3.2.2.6 SDS-PAGE 凝胶电泳  88-89
      3.2.2.7 GST 融合表达载体构建及表达体系优化  89-91
      3.2.2.8 GST 融合蛋白分离、纯化及酶活性分析  91-95
    3.2.3 结果与分析  95-117
      3.2.3.1 OsOPR 蛋白同源建模模板选择  95-97
      3.2.3.2 OsOPR 蛋白同源建模及结构比较  97-103
      3.2.3.3 GST-OsOPR 融合表达载体构建  103-107
      3.2.3.4 GST-OsOPR 融合表达体系优化  107-109
      3.2.3.5 GST-OsOPR 融合蛋白表达与纯化  109-112
      3.2.3.6 GST-OsOPR 融合蛋白酶活性分析  112-117
  3.3 OsOPR 家族基因生理功能研究  117-158
    3.3.1 材料与试剂  118-125
      3.3.1.1 植物材料  118-119
      3.3.1.2 菌株与载体  119-120
      3.3.1.3 仪器与试剂  120-125
    3.3.2 实验方法  125-140
      3.3.2.1 启动子顺式作用元件分析  125
      3.3.2.2 MPSS 芯片数据分析  125
      3.3.2.3 水稻幼苗诱导处理  125-127
      3.3.2.4 植物总RNA 提取及半定量RT-PCR  127-130
      3.3.2.5 农杆菌感受态细胞制备、转化及重组子鉴定  130-132
      3.3.2.6 过表达载体构建及烟草叶盘法转化  132-136
      3.3.2.7 转基因烟草DNA 及RNA 水平分子鉴定  136-138
      3.3.2.8 过表达转基因烟草逆境胁迫处理  138-140
    3.3.3 结果与分析  140-158
      3.3.3.1 OsOPR 家族基因启动子分析  140-141
      3.3.3.2 MPSS 数据库分析OsOPR 家族基因表达谱  141-144
      3.3.3.3 半定量RT-PCR 分析OsOPR 家族基因表达谱  144-148
      3.3.3.4 OsOPR 家族基因过表达转化烟草的初步研究  148-158
  3.4 讨论  158-162
    3.4.1 OsOPR 家族基因可能的生物学功能  158-162
  3.5 小结  162-163
第4章总结与展望  163-168
  4.1 总结  163-166
    4.1.1 植物OPR 基因家族系统进化研究  163-164
    4.1.2 OsOPR 家族基因分子生物学功能研究  164-166
  4.2 展望  166-168
参考文献  168-184
附录  184-221
  附录1 缩略词表  184-187
  附录2 植物OPR 家族基因信息  187-191
  附录3 植物OPR 家族基因氨基酸序列比对  191-198
  附录4 植物OPR 家族基因系统发育树  198-199
  附录5 植物OPR 家族蛋白功能分化相关氨基酸位点分布  199-200
  附录6 OsOPR 家族基因干涉转化水稻的初步研究  200-218
  附录7 本研究所用引物序列信息  218-220
  附录8 在研期间论文发表情况  220-221
致谢  221

植物OPR基因家族系统发育分析及水稻OPR家族基因分子生物学功能研究

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