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饲料中精氨酸水平和糖脂比对大口黑鲈生长相关的激素mRNA表达的影响

作　者: 靳利娜
导　师: 陈乃松
学　校: 上海海洋大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 大口黑鲈 精氨酸 糖脂比 生长激素 类胰岛素生长因子-Ⅰ 胰岛素 克隆 实时荧光定量PCR
分类号: S963
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究以大口黑鲈(Micropterus salmoides)为研究对象,克隆获得其肝脏胰岛素基因cDNA全序列,并研究了饲料中不同精氨酸(Arg)水平以及糖脂比(碳水化合物与脂肪比)对大口黑鲈脑垂体生长激素(GH)、肝脏类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和胰岛素mRNA表达的影响。本研究的结果如下:1.大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析用RT-PCR和RACE技术克隆了大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5’端非翻译区101 bp、3’端非翻译区213 bp和开放读码框(ORF)351 bp。该开放读码框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 kDa,理论等电点为5.44。在线分析表明:推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在明显的疏水区和一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24-Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,且大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列与硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75-94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59-62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鰺和尼罗罗非鱼的前胰岛素原同源性较高。2.饲料中精氨酸水平对大口黑鲈GH、IGF-Ι和胰岛素mRNA表达的影响运用实时荧光定量PCR技术,研究饲料中不同精氨酸水平对大口黑鲈生长和脑垂体GH、肝脏IGF-Ⅰ和胰岛素mRNA表达的影响。实验结果表明,随着饲料中精氨酸水平的增加,大口黑鲈的特定生长率(SGR)呈升高趋势,当Arg水平达到3.01%时,SGR达到最大值(P < 0.05),而其他组无显著性差异(P > 0.05)。当饲料中Arg水平在1.70-2.52%间时,脑垂体GH mRNA水平没有显著性差异(P > 0.05),直到Arg水平达到2.76%时,GH mRNA表达发生显著性的上调(P < 0.05)。随饲料Arg水平从1.70%升高到2.23%,肝脏IGF-ⅠmRNA表达呈显著上调趋势(P < 0.05);当Arg水平高于2.23%时,IGF-ⅠmRNA水平呈不规则波动(P > 0.05)。肝脏胰岛素mRNA水平不受饲料Arg水平的影响。皮尔逊相关性分析显示,肝脏IGF-ⅠmRNA水平与SGR间呈显著的强正相关(P=0.017, r=0.892)。本实验结果表明,饲料中Arg对大口黑鲈生长,脑垂体GH和肝脏IGF-ⅠmRNA的表达均有影响。3.饲料中糖脂比对大口黑鲈GH、IGF-Ι和胰岛素mRNA表达的影响运用实时荧光定量PCR技术,研究不同的糖脂(CHO/LIP)比对大口黑鲈生长和脑垂体GH、肝脏IGF-Ⅰ和胰岛素mRNA表达的影响。当饲料中糖脂比为0.32时,特定生长率(SGR)达到较高值(P < 0.05),其他组SGR均无显著性差异(P > 0.05)。当饲料中糖脂比不高于2.36时,脑垂体GH和肝脏胰岛素mRNA水平均呈现出显著性上升趋势(P < 0.05),但肝脏IGF-ⅠmRNA水平呈显著线性下降趋势;但当糖脂比高于2.36时,其mRNA表达不再发生显著变化(P > 0.05)。皮尔逊相关性分析显示,当饲料中糖脂比位于0.32-2.36间时,糖脂比与胰岛素mRNA表达呈显著的线性正相关(P=0.038,r=0.962)。肝脏IGF-ⅠmRNA水平与脑垂体GH mRNA水平存在极高的负相关(P=0.000,r= -0.984);SGR与脑垂体GH mRNA水平有显著的负相关(P=0.041,r= -0.829),而与肝脏IGF-ⅠmRNA表达存在显著的正相关(P=0.019,r=0.885)。本实验结果表明,饲料中糖脂比对大口黑鲈生长,脑垂体GH、肝脏IGF-Ⅰ和胰岛素mRNA的表达均有影响,且生长与IGF-ⅠmRNA表达呈显著的正相关关系,而与GH呈负相关。以上基因mRNA表达丰度的变化可反映出营养因子对大口黑鲈生长的内分泌调控机制的影响。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-13
引言  13-25
  1 动物生长激素轴的概况  13
  2 生长激素轴的成员及其促鱼类生长的作用机理  13-19
    2.1 GH、GHR 和GHBPs 及其作用机理  13-16
    2.2 类胰岛素样生长因子系统及其作用机理  16-19
  3 胰岛素的概况及其对鱼类代谢的作用  19-20
  4 环境因素对生长激素轴及胰岛素的影响  20-23
    4.1 环境因素对生长激素轴的影响  20-23
      4.1.1 营养状况对生长激素轴的影响  20-22
      4.1.2 生活环境对生长激素轴的影响  22-23
    4.2 营养状况对胰岛素的影响  23
  5 本研究的目的和意义  23-25
第一章 大口黑鲈胰岛素基因全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析  25-38
  1 实验材料  25-26
    1.1 动物材料  25
    1.2 菌种和载体  25
    1.3 实验试剂  25
    1.4 实验仪器  25
    1.5 培养基及主要试剂的配制  25-26
  2 实验方法  26-31
    2.1 大口黑鲈肝脏总RNA 的提取  26
    2.2 胰岛素部分cDNA 的扩增、克隆和序列测定  26-29
      2.2.1 反转录  26-27
      2.2.2 聚合酶链式反应（PCR）  27
      2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测及割胶回收  27-28
      2.2.4 PCR 回收产物与pMD19-T 载体连接  28
      2.2.5 目的DNA 转化入感受态细胞  28
      2.2.6 重组克隆筛选和菌液扩大培养  28-29
      2.2.7 重组DNA 核苷酸序列测定分析  29
    2.3 cDNA 末端快速扩增（RACE）PCR  29-31
    2.4 胰岛素cDNA 全序列分析  31
  3 实验结果与分析  31-36
    3.1 肝脏RNA 和前胰岛素原基因RT-PCR 产物电泳结果  31-32
    3.2 前胰岛素原基因cDNA 序列及其特征分析  32
    3.3 前胰岛素原氨基酸的序列分析及其与其他鱼类前胰岛素原氨基酸序列的比对  32-34
    3.4 前胰岛素原蛋白的结构预测分析  34-35
    3.5 前胰岛素原氨基酸序列同源性及分子进化分析  35-36
  4 讨论  36-38
第二章 饲料中精氨酸水平对大口黑鲈GH、IGF-Ι和胰岛素MRNA 表达的影响  38-51
  1 实验材料  38
    1.1 动物材料  38
    1.2 实验饲料  38
    1.3 实验试剂  38
    1.4 实验仪器  38
  2 实验方法  38-43
    2.1 养殖试验  38-39
    2.2 取样  39
    2.3 大口黑鲈脑垂体和肝脏总RNA 提取  39
    2.4 反转录  39
    2.5 实时荧光定量PCR 引物的设计  39-40
    2.6 聚合酶链式反应（PCR）  40-42
    2.7 内参基因的筛选  42
    2.8 琼脂糖凝胶电泳及割胶回收，标准曲线制备  42
      2.8.1 琼脂糖凝胶电泳及割胶回收  42
      2.8.2 制备标准曲线  42
    2.9 实时荧光定量PCR  42
    2.10 数据处理  42-43
  3 实验结果  43-49
    3.1 目的基因和内参基因实时荧光定量PCR 产物电泳结果  43-45
    3.2 实时荧光定量PCR 的标准曲线和融解曲线分析  45
    3.3 饲料中精氨酸水平对大口黑鲈GH、IGF-Ι和胰岛素mRNA 表达的影响  45-49
      3.3.1 精氨酸对大口黑鲈生长的影响  45-46
      3.3.2 精氨酸对大口黑鲈脑垂体GH mRNA 表达的影响  46-47
      3.3.3 精氨酸对大口黑鲈肝脏IGF-ΙmRNA 表达的影响  47
      3.3.4 精氨酸对大口黑鲈肝脏胰岛素mRNA 表达的影响  47-48
      3.3.5 饲料精氨酸水平，基因表达以及生长之间的关系  48-49
  4 讨论  49-51
    4.1 饲料中精氨酸水平对大口黑鲈脑垂体GH mRNA 表达的影响  49
    4.2 饲料中精氨酸水平对大口黑鲈肝脏IGF-ΙmRNA 表达的影响  49
    4.3 饲料中精氨酸水平对大口黑鲈肝脏胰岛素m RNA 表达的影响  49-50
    4.4 大口黑鲈肝脏IGF-ΙmRNA水平与其生长的关系  50-51
第三章 饲料中糖脂比对大口黑鲈GH、IGF-Ι和胰岛素MRNA 表达的影响  51-58
  1 实验材料  51
    1.1 动物材料  51
    1.2 实验饲料  51
    1.3 实验试剂  51
    1.4 实验仪器  51
  2 实验方法  51-52
    2.1 养殖试验  51
    2.2 取样  51
    2.3 大口黑鲈脑垂体和肝脏总RNA 提取  51-52
    2.4 反转录  52
    2.5 实时荧光定量PCR 引物的设计  52
    2.6 聚合酶链式反应（PCR）  52
    2.7 内参基因的筛选  52
    2.8 琼脂糖凝胶电泳及割胶回收，标准曲线制备  52
      2.8.1 琼脂糖凝胶电泳及割胶回收  52
      2.8.2 制备标准曲线  52
    2.9 实时荧光定量PCR  52
    2.10 数据处理  52
  3 实验结果  52-56
    3.1 糖脂比对大口黑鲈生长的影响  52-53
    3.2 糖脂比对大口黑鲈脑垂体GH mRNA 表达的影响  53
    3.3 糖脂比对大口黑鲈肝脏IGF-ΙmRNA 表达的影响  53-54
    3.4 糖脂比对大口黑鲈肝脏胰岛素mRNA 表达的影响  54-55
    3.5 饲料糖脂比，基因表达与生长之间的关系  55-56
  4 讨论  56-58
    4.1 饲料中糖脂比对大口黑鲈脑垂体GH mRNA 表达的影响  56-57
    4.2 饲料中糖脂比对大口黑鲈肝脏IGF-ΙmRNA 表达的影响  57
    4.3 饲料中糖脂比对大口黑鲈肝脏胰岛素mRNA 表达的影响  57
    4.4 大口黑鲈肝脏IGF-Ι和脑垂体GH mRNA水平与其生长的关系  57-58
小结  58-59
参考文献  59-67
附录  67-68
致谢  68

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产养殖技术 > 水产动物饵料及其营养
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