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坛紫菜hsp70真核表达载体的构建及表达

作　者: 仪茜茜
导　师: 杨锐
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: hsp70 坛紫菜酵母表达系统实时荧光定量PCR
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

紫菜是重要的经济海藻,广泛分布在我国沿海的潮间带,多变的生存环境使其对逆境胁迫有着特殊的适应性,尤其是对温度、渗透压和高辐射等逆境具有快速和高效的调节机制。深入研究紫菜抗逆相关基因及其功能对于我们了解生物抗逆机理具有重要帮助。本研究坛紫菜 hsp70为目的基因,基于真核表达质粒p181AINE,构建了坛紫菜hsp70真核表达载体p181-hsp70,经PCR扩增、酶切及测序等方法鉴定表明该真核表达载体构建成功。利用电激转化的方法将表达载体导入野生型酵母菌株BY4741和SSA3(诱导型hsp70)基因缺失型的酵母菌株YBL075c中,进行了表达。测定了重组酵母菌株的生长曲线,利用实时荧光定量PCR技术研究了重组野生(过量表达)型酵母(BY4741+p181-hsp70)和缺失补偿型酵母(YBL075c+p181-hsp70)两菌株当中的外源基因hsp70在短时热激下的相对表达情况,,并利用NMR技术进行重组酵母的代谢组学的初步研究。实验结果显示:1、在30℃和40℃培养条件下,重组野生(过量表达)型酵母菌株(BY4741+p181-hsp70)、缺失补偿型酵母菌株(YBL075c+p181-hsp70)与其对照组菌株相比,生长状况均无明显差异;45℃培养条件下,缺失补偿型重组酵母与其对照组均不生长;转空质粒的野生型对照(BY4741+p181AINE)几乎不生长,而重组酵母BY4741+p181-hsp70生长状况明显好于该对照,但二者均不及在30℃和40℃条件下的生长状况。2、以酵母18S rDNA为内源特异性参照基因,利用实时荧光定量PCR技术,对重组野生(过量表达)型酵母(BY4741+p181-hsp70)和缺失补偿型酵母两个菌株当中的外源基因hsp70在短时热激下的相对表达情况进行了研究。结果表明:两个类型的重组菌在热激5min时外源hsp70的表达量下降,15min时上升,30min时又略降低,外源基因表达的总趋势相似;而重组野生型酵母在热激5min时,hsp70表达量较少,仅为(相应)对照的0.75倍,缺失型重组酵母在热激15min时的表达量增加较多,达到(相应)对照的1.5倍。造成该现象的原因,推测重组质粒上启动子的类型与酵母SSA3中的热激调控元件(诱导元件)可能影响外源基因转录水平上的表达效率。3、以NMR技术进行重组酵母的代谢组学分析,发现缺失补偿型酵母与其对照之间无明显差异,而重组野生型酵母的代谢组成分较对照组产生明显差异,但这些成分的具体归属及作用有待进一步分析。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-11
1 热激蛋白70 在藻类中的研究进展与功能基因研究方法  11-19
  1.1 藻类hsp70 研究现状  12-13
  1.2 功能基因的研究方法与技术  13-19
    1.2.1 基因表达序列分析与微阵列分析  14
    1.2.2 DNA 多态性  14-15
    1.2.3 T-DNA 标签法  15-16
    1.2.4 RNAi 干扰  16
    1.2.5 代谢组学  16-17
    1.2.6 生物信息学  17-19
2 坛紫菜hsp70 真核表达载体的构建  19-27
  2.1 材料与方法  19-22
    2.1.1 实验材料  19-20
    2.1.2 实验方法  20-22
  2.2 结果与分析  22-25
    2.2.1 坛紫菜hsp70 的克隆和测序  22-23
    2.2.2 坛紫菜重组表达载体p181- hsp70 的构建  23
    2.2.3 重组表达质粒p181AINE- hsp70 的鉴定  23-25
  2.3 讨论  25-26
  本章小结  26-27
3 坛紫菜hsp70 重组表达质粒的转化与表达  27-39
  3.1 材料与方法  28-31
    3.1.1 质粒与菌种  28
    3.1.2 主要试剂与设备  28
    3.1.3 培养基  28-29
    3.1.4 实验方法  29-31
  3.2 结果与分析  31-36
    3.2.1 重组表达酵母的获得与鉴定  31-32
    3.2.2 重组表达酵母生长曲线的测定  32
    3.2.3 hsp70 在重组酵母内的表达研究  32-36
  3.3 讨论  36-38
  本章小结  38-39
4 重组表达酵母代谢组学分析  39-46
  4.1 材料与方法  39-41
    4.1.1 实验材料  39-40
    4.1.2 实验方法  40-41
  4.2 结果与分析  41-43
  4.3 讨论  43-45
  本章小结  45-46
5 结论  46-47
参考文献  47-56
附录A DH-5α大肠杆菌感受态的制备  56-57
附录B 省却混合物的配方  57-58
附录C 酵母电转化法  58-59
附录D 坛紫菜丝状体基因组DNA 的提取  59-60
在学研究成果  60-61
致谢  61-62

坛紫菜hsp70真核表达载体的构建及表达

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