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伏马菌素诱导拟南芥程序性细胞死亡的细胞生物学研究

作　者: 方策
导　师: 姚楠
学　校: 中山大学
专　业: 植物学
关键词: 伏马菌素B1(FB1) 程序性细胞死亡(PCD) 线粒体形态和动态变化 活性氧(ROS) 细胞骨架
分类号: Q942
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


伏马菌素B1(Fumonisin B1,FB1)是由串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)产生的一种重要真菌毒素,具有与鞘氨醇长链基相类似的结构。由于FB1危害玉米、水稻、小麦等多种农产品及饲料,涉及到植物、动物以及人类健康和食品安全,研究和发掘其毒性作用机制是急需解决的重要科学问题。虽然已有研究发现FB1能诱导植物细胞发生程序性细胞死亡,引发植株病害,但是参与调控死亡和病害的信号分子,及其致死机理和作用靶标仍然是不清楚的。本研究以拟南芥野生型、绿色荧光蛋白(GFP)特异标记各种细胞器的株系以及鞘脂代谢途径中的acd5突变体为材料,采用多种细胞生物学技术,结合相关抑制剂的使用,对FB1诱导植物程序性细胞死亡过程中的信号转导、细胞生理状态、细胞器形态和动态变化以及超微结构变化等方面进行了详细研究。利用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜观察和流式细胞术,我们发现,在FB1诱导拟南芥原生质体发生细胞死亡的早期,线粒体中产生了大量过氧化氢(H2O2),同时伴随着线粒体跨膜电势的急剧下降。添加自由基清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸后,有效的降低了活性氧并可以部分阻止FB1诱导的细胞死亡。通过钙离子特异荧光染料Fluo-4染色,YC-FRET法与一氧化氮特异荧光染料DAF染色分别对细胞内钙离子和一氧化氮浓度进行了检测,研究发现FB1并不会引起细胞内两者水平发生显著变化。我们采用GFP特异标记线粒体的拟南芥品系43A9,通过共聚焦显微镜获取大量三维(xyz)和四维(xyzt)的线粒体图片数据,对FB1诱导的细胞死亡过程中线粒体分布、形态、数量、运动轨迹及速率进行了准确而全面的大样本统计分析。研究发现,在对照组中线粒体形态正常,分布规则,运动速率快且运动轨迹复杂。而在FB1诱导的细胞死亡早期,线粒体发生异常的聚集现象;接着线粒体的体积发生极为显著的膨大,同时伴随着线粒体总数目的急剧下降。这些形态和分布异常的线粒体运动的复杂性和速率都显著降低。通过细胞骨架抑制剂处理和细胞内ATP浓度测定,发现线粒体的形态和动态变化依赖于微丝,而不依赖于微管和细胞内ATP浓度。同时微丝解聚剂能够显著增强FB1对拟南芥原生质体和叶片的致死作用。用FB1处理GFP特异标记微丝的拟南芥品系GFP-FABD2后,发现在线粒体发生明显的形态和动态变化之前,微丝结构就已经遭受到了严重的解聚和降解,说明FB1很可能直接作用于微丝,而微丝结构破坏是造成线粒体动态变化的重要原因。在电镜下,采用三氯化铈(CeCl3)组织化学染色,我们对FB1诱导拟南芥叶片死亡过程中的亚细胞形态变化及H2O2超微结构定位进行了观察。研究发现细胞死亡早期H2O2信号首先出现在细胞壁上,随着处理时间延长,H2O2信号逐渐增强,随后在线粒体外膜上大量迸发,到死亡后期H2O2信号又逐渐消失了,经历了一个从无到有又到无的一个过程。在亚细胞形态方面,我们观察到了细胞核内膜周围有异染色质凝缩现象,这是程序性细胞死亡的典型特征;在死亡后期,细胞内容物排列紊乱,叶绿体和细胞质中出现了大量的脂滴,还观察到由真菌毒素诱导产生的乳突结构。在注射FB1植株上的未注射叶片的细胞中也观察到了上述相同的信号和结构变化,推测FB1可能通过维管束组织转运至其他叶片进而扩大致病范围。采用鞘脂代谢途径上的死亡相关拟南芥突变体acd5研究发现,不论是FB1处理还是串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)侵染,acd5突变体都要比野生型显得更为敏感,会更早更多地出现死细胞。实验发现acd5突变体H2O2信号和胼胝质起始的时间和合成的强度都比野生型要晚,要弱。推测可能是由于鞘质代谢途径的紊乱使得这些抗性信号的产生和防御结构的合成受到推迟和减弱,从而降低了acd5突变体的整体抗性。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第一章 前言  11-54
  1.1 植物鞘脂代谢途径  11-16
    1.1.1 植物鞘脂的结构  11-12
    1.1.2 植物中鞘脂的合成代谢途径  12-13
    1.1.3 鞘脂的功能  13-15
    1.1.4 神经酰胺激酶与acd5 突变体  15-16
  1.2 串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）与伏马菌素B1（FB1）  16-20
    1.2.1 串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）  16
    1.2.2 FB1 的结构  16-17
    1.2.3 FB1 能诱导动物细胞发生程序性细胞死亡  17-18
    1.2.4 FB1 能诱导植物细胞发生程序性细胞死亡  18-20
  1.3 参与植物PCD 调控的信号途径  20-33
    1.3.1 ROS  21-27
    1.3.2 NO  27-28
    1.3.3 Ca~(2+)  28-33
  1.4 参与程序性细胞死亡调控的主要细胞器  33-42
    1.4.1 线粒体  33-37
    1.4.2 叶绿体  37-39
    1.4.3 液泡  39-40
    1.4.4 细胞骨架  40-42
  1.5 细胞器形态及动态定量分析研究进展  42-51
    1.5.1 细胞器形态及动态显微成像技术进展简介  42-46
    1.5.2 细胞器形态及动态定量分析研究进展及方法改进  46-51
  1.6 本研究选题依据及技术路线  51-54
    1.6.1 选题意义及依据  51-52
    1.6.2 技术路线  52-54
第二章 实验材料与方法  54-70
  2.1 实验材料  54-60
    2.1.1 植物与真菌材料  54
    2.1.2 主要试剂  54-55
    2.1.3 实验所用试剂及培养液配制  55-60
  2.2 实验方法  60-70
    2.2.1 拟南芥种植方法  60-61
    2.2.2 拟南芥叶肉原生质体提取  61
    2.2.3 原生质体的处理和细胞存活率统计分析  61-62
    2.2.4 叶片注射处理  62
    2.2.5 流式细胞仪检测线粒体跨膜电势  62
    2.2.6 FRET 荧光比率法检测胞质钙离子浓度变化  62-63
    2.2.7 激光扫描共聚焦显微镜图像获取  63-64
    2.2.8 3D，4D 共聚焦显微图像数据处理及测量  64
    2.2.9 细胞内ATP 提取及含量测定  64-65
    2.2.10 通过CeC1_3 染色对过氧化氢进行亚细胞定位  65
    2.2.11 串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）的活化与培养  65-66
    2.2.12 串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）孢子分离方法  66-67
    2.2.13 真菌孢子的计数方法  67
    2.2.14 真菌接种拟南芥  67-68
    2.2.15 植物叶片台盼蓝染色方法  68
    2.2.16 植物叶片DAB 染色方法  68
    2.2.17 植物叶片苯胺蓝（aniline blue）染色方法  68-69
    2.2.18 植物叶片病斑拍摄  69-70
第三章 结果  70-113
  3.1 FB1 诱导拟南芥发生程序性细胞死亡过程中的信号及亚细胞结构变化的研究  70-95
    3.1.1 FB1 诱导拟南芥原生质体与叶片发生程序性细胞死亡  70
    3.1.2 FB1 诱导细胞死亡过程中的活性氧信号  70-72
    3.1.3 FB1 诱导细胞死亡过程中的线粒体跨膜电势变化  72-74
    3.1.4 FB1 诱导细胞死亡过程中的NO 信号  74
    3.1.5 FB1 诱导细胞死亡过程中的胞质Ca~(2+)浓度变化  74-77
    3.1.6 FB1 对线粒体在细胞内的分布和形态的影响  77-79
    3.1.7 FB1 对线粒体运动速率和运动轨迹的影响  79-81
    3.1.8 细胞骨架和肌球蛋白抑制剂对线粒体在细胞内的分布、形态及运动速率的影响  81-84
    3.1.9 FB1 和细胞骨架抑制剂对植物细胞骨架的影响  84-86
    3.1.10 细胞骨架抑制剂对FB1 诱导细胞死亡的作用  86-88
    3.1.11 FB1 和细胞骨架抑制剂对细胞内ATP 浓度的影响  88-89
    3.1.12 FB1 在拟南芥叶片上诱导细胞死亡过程中的亚细胞形态变化及过氧化氢超微结构定位  89-95
  3.2 FB1 对拟南芥野生型和acd5 突变体的作用对比  95-103
    3.2.1 K1 抑制剂、FB1 以及C2 神经酰胺对拟南芥野生型和acd5 突变体的致死作用对比  95-98
    3.2.2 acd5 突变体在FB1 诱导的细胞死亡过程中的H_20_2 信号及亚细胞结构变化  98-103
  3.3 产毒和非产毒串珠镰刀菌对野生型和acd5 突变体的侵染研究  103-113
    3.3.1 产毒和非产毒串珠镰刀菌在野生型和acd5 突变体上的病斑发生  103-106
    3.3.2 产毒和非产毒串珠镰刀菌在野生型和acd5 突变体中诱导的死细胞、H_20_2 信号及胼胝质观察  106-113
第四章 讨论  113-119
  4.1 FB1 诱导PCD 过程中的ROS  113-114
  4.2 细胞骨架与胞内ATP 水平在FB1 诱导的线粒体形态和动态变化过程中的作用  114-115
  4.3 胞内ATP 在FB1 诱导PCD 过程中的作用及来源  115-117
  4.4 FB1 在串珠镰刀菌侵染植物过程中的作用  117-118
  4.5 ACD5 对植物抗性的影响  118-119
第五章 总结与展望  119-122
  5.1 总结  119-120
  5.2 展望  120-122
参考文献  122-140
附录Ⅰ 缩略词表  140-142
附录Ⅱ 在读期间发表的论文  142-143
致谢  143-144

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞学
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