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拟南芥AT14A蛋白在介导细胞壁—质膜—细胞骨架连续体中的功能研究

作　者: 王洪成
导　师: 梁建生；吕冰
学　校: 扬州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥 AT14A蛋白细胞壁-质膜-细胞骨架连续体类整合素蛋白细胞骨架分裂泛素化酵母双杂交
分类号: Q942
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

动物细胞中存在着细胞外基质-粘附分子(整合素等)-细胞骨架连续体,该连续体在细胞内外信号的传递和转换中发挥着极其重要的作用。而植物细胞胞外基质则是由纤维素、半纤维素和果胶等成分组成的细胞壁。近年来的研究认为,植物中也存在一个细胞壁-质膜-细胞骨架连续体,并能感受外界的变化并做出相应的反应。AT14A是拟南芥中一个与整合素蛋白具有部分同源序列的未知功能蛋白,目前对于AT14A蛋白是否为拟南芥中的类似动物整合素的蛋白(类整合素)还缺乏直接的证据。本文主要就AT14A蛋白在介导拟南芥细胞间的相互粘附及在介导细胞壁-质膜-细胞骨架连续体中的作用入手来研究其功能。主要结果如下:1、采用农杆菌介导的转基因方法,将AT14A-GFP融合基因转至拟南芥野生型和AT14A突变体悬浮细胞中。从而构建拟南芥AT14A过表达和at14a-AT14A基因型悬浮细胞,为进一步研究AT14A的功能提供实验材料。GFP抗体的western blotting结果,证明在拟南芥AT14A过表达和at14a-AT14A基因型悬浮细胞中均存在融合蛋白的表达。2、细胞形态观察结果表明,突变体细胞与at14a-AT14A基因型细胞类似,与野生型和过表达基因型细胞形态相比,细胞形态变小、变圆。利用荧光定位技术,结合荧光显微镜的观察发现,缺失型突变体at14a悬浮细胞的微丝束变粗,且排列变得稀疏,而过表达转AT14A-GFP融合基因的悬浮细胞的微丝排列较野生型密集;缺失型突变体at14a悬浮细胞的微管排列杂乱而无规则,但过表达转AT14A-GFP融合基因细胞的微管形态及排列与野生型无明显区别。但是,at14a-AT14A基因型的细胞骨架形态与突变体类似。说明AT14A蛋白与细胞骨架系统关系密切,影响了细胞形态。3、通过对类整合素蛋白参与细胞壁与细胞膜之间的粘连作用进行药理学研究发现,在用类整合素相关物质RGD处理后,各基因型细胞均发生一定的质壁分离现象,但突变体变化不及其它三种基因型明显。在用渗透胁迫处理后,突变体基因型细胞质壁分离明显,而at14a-AT14A基因型质壁分离情况与野生型和过表达基因型类似。在用类整合素相关物质RGD处理后,再进行渗透胁迫处理,则突变体基因型的质壁分离情况与仅用胁迫处理时的质壁分离情况类似,而其它三种基因型较之则发生了显著的质壁分离。说明AT14A蛋白有利于细胞壁和细胞质膜间的联结。4、对四种基因型细胞的粘附程度进行分析发现,突变体的细胞聚集程度明显低于野生型和过表达基因型,而在转AT14A-GFP后,at14a-AT14A基因型细胞的聚集程度明显增强,达到了野生型水平。说明AT14A蛋白在细胞粘附方面发挥了直接作用。5、采用类整合素和细胞骨架相关物质对细胞进行处理后,观察细胞骨架系统。结果表明,用微管或微丝解聚剂处理后,突变体基因型的细胞骨架系统的解聚较野生型与过表达更加明显;而at14a-AT14A基因型在微管或微丝解聚剂处理后,解聚现象较突变体基因型细胞有一定程度的弱化。6、通过分裂泛素化酵母双杂交发现,AT14A与肌动蛋白没有直接的相互作用,因此推测AT14A对细胞骨架形态的影响可能通过间接地方式进行,例如通过与肌动蛋白结合蛋白相互作用,来进一步影响细胞骨架的形态。总之,AT14A蛋白在介导拟南芥细胞与细胞之间的相互联系和介导细胞壁-质膜-细胞骨架连续体中发挥重要作用。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
中英文对照词  10-12
第一章文献综述  12-30
  1 引言  12-13
  2 哺乳动物整合素介导的信号转导  13-20
    2.1 整合素的结构及分类  13-15
    2.2 整合素的功能  15-20
      2.2.1 细胞与胞外基质间的联结  15-16
      2.2.2 细胞信号传导  16-20
        2.2.2.1 介导由细胞内向外的信号传导  17-18
        2.2.2.2 介导由细胞外向细胞内的信号传导  18-20
  3 植物类整合素蛋白研究  20-23
    3.1 植物类整合素蛋白的检测及鉴定  20-22
    3.2 植物类整合素蛋白的功能  22-23
  4 植物细胞骨架---微管与微丝  23-26
    4.1 微管概述  24-25
    4.2 微管功能  25
    4.3 微丝概述  25-26
    4.4 微丝功能  26
  5 蛋白质相互作用研究——分裂泛素化酵母双杂交系统  26-28
  6 小结  28-30
第二章拟南芥 AT14A 基因过表达及其突变体转 AT14A-GFP 基因型悬浮细胞体系的建立及鉴定分析  30-41
  1 引言  30-31
  2 材料与方法  31-34
    2.1 根癌农杆菌介导法转AT14A-GFP 基因于拟南芥悬浮细胞  31
    2.2 转AT14A-GFP 基因拟南芥悬浮细胞AT14A 与GFP 基因片段的PCR 鉴定  31-32
    2.3 转AT14A-GFP 融合基因拟南芥悬浮细胞的GFP 定位  32
    2.4 转AT14A-GFP 融合基因拟南芥悬浮细胞的western blotting 鉴定  32-33
      2.4.1 细胞总蛋白的提取  32
      2.4.2 蛋白质浓度测定及SDS-PAGE  32
      2.4.3 Western blotting  32-33
        2.4.3.1 转膜  32-33
        2.4.3.2 免疫印迹  33
        2.4.3.3 DAB 显色  33
    2.5 拟南芥悬浮细胞四种基因型AT14A 基因的半定量分析  33-34
      2.5.1 拟南芥悬浮细胞的总RNA 的提取  33
      2.5.2 第一链cDNA 的合成  33
      2.5.3 半定量RT-PCR  33-34
  3 结果与分析  34-39
    3.1 转AT14A-GFP 融合基因愈伤的筛选  34
    3.2 转AT14A-GFP 融合基因悬浮细胞的PCR 鉴定  34-35
    3.3 拟南芥悬浮细胞的GFP 蛋白荧光观察  35-37
    3.4 拟南芥悬浮细胞中AT14A-GFP 融合蛋白的免疫印迹分析  37-38
    3.5 对四种基因型细胞的AT14A 表达程度进行半定量PCR 分析  38-39
  4 讨论  39-41
第三章 AT14A 蛋白在介导细胞壁-质膜-细胞骨架连续体中的初步研究  41-57
  1 引言  41-42
  2 材料与方法  42-44
    2.1 细胞形态观察  42
    2.2 细胞团大小的比较  42
    2.3 拟南芥悬浮细胞处理  42-43
    2.4 拟南芥细胞质壁分离测定方法  43
    2.5 植物类整合素和微管相关物质共处理方法  43
    2.6 植物类整合素和微丝相关物质共处理方法  43
    2.7 细胞骨架蛋白（微管和微丝蛋白）的荧光定位  43-44
  3 结果与分析  44-56
    3.1 细胞形态观察图  44-45
    3.2 不同基因型悬浮培养细胞间黏附差异比较  45
    3.3 类整合素蛋白参与细胞壁与细胞膜之间的粘连作用的药理学研究  45-47
    3.4 植物类整合素和微管相关物质共处理对拟南芥细胞微管的影响  47-52
    3.5 植物类整合素和微丝相关物质共处理对拟南芥细胞微丝的影响  52-56
  4 讨论  56-57
第四章 AT14A 与 ACTIN8 蛋白间的相互作用研究  57-70
  1 引言  57-58
  2 材料与方法  58-63
    2.1 目的基因AT14A 和ACTIN8 的PCR 扩增  58-59
    2.2 PCR 产物的回收  59
    2.3 目的基因连到pMD 18-T simple vector  59-60
    2.4 大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化  60
      2.4.1 大肠杆菌DH5α感受态的制备  60
      2.4.2 大肠杆菌（E.coli）DH5α的转化  60
    2.5 阳性克隆菌的筛选  60-61
    2.6 DNA 序列分析  61
    2.7 表达载体pMET/AT14A 和pCUP/ACTIN8 的构建  61-62
      2.7.1 pMD 18-T simple vector-AT14A  61
      2.7.2 表达载体pMET/AT14A 和pCUP/ACTIN8 的构建  61
      2.7.3 重组子pMET/AT14A 和pCUP/ACTIN8 的鉴定  61
      2.7.4 质粒的小量制备  61
      2.7.5 重组质粒的双酶切鉴定  61-62
    2.8 酵母宿主细胞JD53 的鉴定  62
    2.9 酵母感受态细胞的制备及转化  62
    2.10 双杂交载体中AT14A 和ACTIN8 蛋白的表达及毒性检测  62-63
    2.11 AT14A 和ACTIN8 蛋白的相互作用研究  63
  3 结果与分析  63-69
    3.1 PCR 扩增目的基因  63
    3.2 TA 克隆产物的鉴定  63-64
    3.3 序列比对结果  64
    3.4 目的基因与表达载体连接产物鉴定  64-67
    3.5 JD53 表型鉴定  67
    3.6 双杂交载体中目的蛋白的表达及毒性检测结果  67-68
    3.7 AT14A 和ACTIN8 蛋白相互作用验证  68-69
  4 讨论  69-70
第五章总结与讨论  70-73
参考文献  73-80
附录  80-89
致谢  89

拟南芥AT14A蛋白在介导细胞壁—质膜—细胞骨架连续体中的功能研究

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