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温光敏雄性不育小麦穗部发育时期均一化cDNA文库的构建、鉴定和EST分析以及减数分裂时期细胞骨架荧光标记体系探索

作　者: 杨迪
导　师: 郑用琏
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 表达序列标签基因本体论均一化cDNA文库温光敏雄性不育细胞骨架
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 58次
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内容摘要

小麦温光敏雄性不育材料为我国特有资源,拥有完全独立的自主知识产权,近十年来发展极为迅速,已经成为国内外小麦杂种优势利用的主要育种途径。本实验以温光敏雄性不育系BS20为材料,进行均一化cDNA文库构建、大规模cDNA测序、EST序列生物信息学分析,以及小麦雄蕊发育过程中微管、微丝细胞骨架激光共聚焦荧光标记体系探索等方面的研究,旨在为更好的揭示温光敏雄性不育分子机理搭建平台。本实验所获得的主要研究结果如下:1.温光敏雄性不育小麦穗部发育时期均一化cDNA文库构建、鉴定和EST分析(1)按照雄蕊不同发育时期,即小花分化期,药隔形成期,小孢子母细胞时期,四分体时期,单核花粉期和成熟花粉期,构建了6个独立的温光敏雄性不育小麦穗部和花药组织cDNA文库。除了小孢子母细胞时期构建的文库之外,其余5个文库的重组率均为100%。每个独立文库的库容量在1.6×10~6-2.0×10~7之间,平均插入片段长度大于0.85 kb。(2)通过与基因组饱和杂交的方法混合6个独立cDNA文库构建穗部发育时期均一化cDNA文库。文库库容量为4.0×10~5,平均插入片段长度为1.3 kb。(3)从均一化cDNA文库中随机挑选3264个克隆进行5′单向测序,剔除长度小于100 bp序列之后,共获得了3223条去载体序列的EST序列,其平均测序长度为926bp。通过聚类和拼接,结果产生2175条非冗余EST聚类,其中包括423条contig和1752条singleton,我们将它们合称为温光敏雄性不育小麦穗部发育相关UniGene(TPGMSSUniGene)。(4)通过综合利用不同序列比对工具的优势,检索多个数据库对TPGMSSUni-Gene进行功能注释。结果显示有60%的UniGene有功能注释。其中有264条(占总数的12%)在CSRD数据库中存在高度同源序列。它们主要是编码初生代谢相关基因、信号转导相关基因和转录调节相关基因。(5)2715个UniGene进行简单重复序列扫描。结果有108个二至六核苷酸为重复基序的SSR位点被找到,其中三核苷酸重复基序的SSR数量最多。2.小麦减数分裂时期细胞骨架荧光标记体系的探索(1)多聚赖氨酸直接粘片法:虽然通过改进固定液配方、针对微管微丝采用不同的固定时间和酶解时间,但还是发现这种方法存在细胞脱落情况严重,组织细胞粘片效果不佳和组织碎片荧光背景干扰等问题,不适合进行小麦雄蕊发育过程中微管、微丝细胞骨架荧光标记。(2)低熔点石蜡切片法:微管、微丝荧光标记效果较好,无背景杂质荧光信号干扰,克服了细胞脱落的情况,可以观察不同发育时期的小孢子细胞骨架结构。通过优化改进实际操作步骤等方面,最终总结出适合小麦雄蕊发育过程中微管、微丝细胞骨架观察的低熔点石蜡切片荧光标记体系。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词表  12-13
第一章温光敏雄性不育小麦穗部发育时期均一化cDNA文库的构建、鉴定和EST分析  13-48
  1.前言  13-25
    1.1 小麦温光敏雄性不育的研究进展  13-17
      1.1.1 温光敏雄性不育小麦败育机制的细胞学观察研究  14-15
      1.1.2 温光敏雄性不育小麦败育机制的生理生化研究  15
      1.1.3 温光敏雄性不育小麦败育机制的分子生物学研究  15-17
    1.2 cDNA文库的构建  17-23
      1.2.1 构建cDNA文库的方法  17-20
        1.2.1.1 经典cDNA文库构建的方法  17
        1.2.1.2 Smart技术构建cDNA文库的方法  17-18
        1.2.1.3 Strategen公司构建cDNA文库的方法  18
        1.2.1.4 Gateway技术构建cDNA文库的方法  18-20
      1.2.2 均一化cDNA文库的构建  20-23
        1.2.2.1 复性式均一化技术  21
        1.2.2.2 基因组饱和杂交技术  21-23
    1.3 植物功能基因组学研究方法  23-25
      1.3.1 生物信息学的研究和应用  24
      1.3.2 EST技术在功能基因组的研究进展  24-25
    1.4 本研究的目的意义  25
  2 实验材料和方法  25-32
    2.1 实验材料  25-26
    2.2 总RNA抽提与mRNA的分离  26-27
    2.3 独立cDNA文库的构建  27-29
      2.3.1 cDNA第一链合成  27
      2.3.2 cDNA第二链合成和双链cDNA提纯  27-28
      2.3.3 attB1接头连接和cDNA片段分级分离  28
      2.3.4 重组反应以及转化感受态细胞  28-29
      2.3.5 cDNA文库的评价  29
    2.4 TPGMS小麦穗部发育期均一化cDNA文库的构建  29-32
      2.4.1 小麦基因组DNA亲和体系的构建  29-32
        2.4.2.2 混合cDNA文库杂交  31
        2.4.2.3 均一化cDNA文库  31-32
    2.5 表达序列标签(EST)大规模测序的数据处理和分析  32
  3 结果  32-42
    3.1 TPGMS小麦穗部发育期独立cDNA文库和均一化文库的构建  32-34
      3.1.1 总RNA和mRNA含量和质量检测  32-34
      3.1.2 独立cDNA文库的构建  34
      3.1.3 均一化cDNA文库的构建  34
    3.2 EST序列的产生和组装拼接  34-36
    3.3 与普通小麦穗部发育相关的EST序列的比较  36
    3.4 EST的注释和功能分类  36-42
      3.4.1 EST的注释  37-38
      3.4.2 EST的功能分类  38-39
        3.4.2.1 运用Blast2GO进行的GO功能分类  38
        3.4.2.2 运用InterPro进行的GO功能分类  38
        3.4.2.3 EST的GO功能分类  38-39
      3.4.3 与已知功能的冷胁迫相关数据库的基因比对  39-42
    3.5 EST-SSR标记的开发  42
  4 讨论  42-48
    4.1 Gateway技术构建6个独立cDNA文库技术的总体评价  42-43
    4.2 均一化cDNA文库技术的评价  43-44
    4.3 EST序列数据分析结果的讨论  44-48
      4.3.1 Blast2go和InterProScan软件在进行GO功能分类时的比较  44-45
      4.3.2 EST的GO功能分类的讨论  45-46
      4.3.3 与CSRD数据库基因比对结果的讨论  46-47
      4.3.4 EST-SSR标记的开发  47-48
第二章温光敏雄性不育小麦减数分裂时期细胞骨架荧光标记体系的建立  48-72
  1 前言  48-55
    1.1 植物细胞骨架的研究进展  48-53
      1.1.1 植物细胞骨架的结构和功能  48-51
        1.1.1.1 微管的结构和功能  49-50
        1.1.1.2 微丝的结构和功能  50-51
      1.1.2 细胞骨架结构与植物雄性不育的研究  51-53
    1.2 细胞骨架荧光标记观察体系的建立  53-55
      1.2.1 细胞骨架特异性标记方法的应用  53-54
      1.2.2 激光共聚焦显微镜在细胞骨架荧光观察中的应用  54-55
    1.3 本研究的目的和意义  55
  2 实验材料和方法  55-61
    2.1 实验材料  55
    2.2 所需试剂溶液的配制  55-57
    2.3 微管的间接免疫荧光标记体系  57-61
      2.3.1 材料的固定和酶解  57-60
        2.3.1.1 多聚赖氨酸直接粘片法  57-58
        2.3.1.2 低熔点石蜡切片法  58-60
      2.3.2 微管的荧光标记  60
        2.3.2.1 标记前的准备  60
        2.3.2.2 微管一抗标记  60
        2.3.2.3 微管二抗标记  60
      2.3.3 封片  60-61
    2.4 微丝免疫荧光标记体系  61
      2.4.1 材料的固定和酶解  61
      2.4.2 微丝的荧光标记  61
      2.4.3 封片  61
    2.5 激光共聚焦显微镜观察  61
  3 结果分析与讨论  61-67
    3.1 小麦细胞骨架荧光标记体系的建立  61-65
      3.1.1 多聚赖氨酸直接粘片法  62-63
        3.1.1.1 采用多聚赖氨酸直接粘片固定微管的标记结果  62
        3.1.1.2 采用多聚赖氨酸直接粘片固定微丝的标记结果  62
        3.1.1.3 针对小麦微管、微丝荧光标记所进行的多聚赖氨酸直接粘片法的改进  62-63
      3.1.2 低熔点石蜡切片法  63-64
        3.1.2.1 采用低熔点石蜡切片固定微管的标记结果  63-64
        3.1.2.2 采用低熔点石蜡切片固定微丝的标记结果  64
        3.1.2.3 针对小麦微管、微丝荧光标记所进行的低熔点石蜡切片法的改进  64
      3.1.3 微丝、微管荧光标记的最佳荧光标记液稀释比例  64-65
    3.2 两种小麦细胞骨架荧光标记体系的比较  65-67
  4 实验展望  67-72
参考文献  72-83
致谢  83-84
附录  84-86
  附录1 Total RNA Extraction  84
  附录2 Oligotex mRNA Spin-Column Protocol(QIAGEN OligotexMaxi kit,Qiagen,Germany)  84-85
  附录3 Plasmid Mini-Preps  85-86
  附录4 Genomic DNA isolation(CTAB method)  86

温光敏雄性不育小麦穗部发育时期均一化cDNA文库的构建、鉴定和EST分析以及减数分裂时期细胞骨架荧光标记体系探索

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