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GM130是顺式高尔基体的基质蛋白,它与p115, giantin, GRASP65, and Rab GTPases等高尔基体相关蛋白相互作用,维持高尔基体的结构、控制糖基化、参与膜泡运输。近年来,又发现它在细胞周期进程、细胞极化、迁移等方面也起作非常重要的作用。在细胞有丝分裂中,GM130参与中心体形成,纺缍体组装并与细胞极性及细胞迁移相关。然而GM130在哺乳动物减数分裂中的作用目前还没有报导。在本课题中,我们深入地研究了GM130在小鼠卵母细胞发育过程中的定位及其可能的作用。免疫荧光标记证明GM130在GV期散在分布于胞浆,似乎在生发泡的周围稍有集中。生发泡破裂后,GM130在细胞中央部分聚集。在第一次减数分裂中期聚集在纺缍体的两极。当卵母细胞发育到第一次减数分裂后期和末期的时候,GM130从纺锤体两极消失,开始与中间体相互关联。到了MII期,GM130又重新定位到纺缍体的两极。并且证实了GM130在MI和MII期与中心体相关蛋白p-MEK1/2共定位。免疫印迹试验证实了GM130在卵母细胞发育的各个时期均有表达。诺考达唑处理试验发现上述GM130的定位与纺缍体的组装是相关的。在小鼠卵母细胞内注射GM130特定的寡聚核苷酸(morpholino),它能与GM130的mRNA或/和DNA结合,特异性抑制其转录或/和翻译,降调其表达水平,注射前后的免疫印迹试验证实了这一点。降调GM130的表达后,我们发现纺缍体组装异常比例升高,且大多数为拉长的纺缍体；第一极体排出率下降,在排出的极体中,大极体的比率升高,并影响微管组织中心相关蛋白γ-tubulin和Plkl的正确定位,但对微丝网络及微丝帽的影响不明显。为了进一步深入研究降调GM130后引起的卵母细胞的缺陷,我们向卵母细胞内注射了β5-tubulin-GFP mRNA和GM130 MO的混合物,并应用了活细胞工作站延时拍摄系统去捕捉纺缍体在降调了GM130后的的动态变化。结果证实了降调GM130,会影响卵母细胞纺缍体的迁移,纺缍体单极拉长,并能与该侧的皮质接触,产生胞质分裂环,导致大极体排出。若拉长的纺缍体尚不能与皮质接触,则细胞阻滞在MI期,没有极体排出。另外,降调GM130的表达也会影响p-MEK1/2在纺缍体极的定位,用MEK的抑制剂U0126处理MI期的卵母细胞则发现GM130不再在纺缍体两极聚集,而是散在分布于胞浆了。结果表明GM130可能与MAPK通路相互作用在小鼠卵母细胞纺缍体组装、迁移及不对称分裂中起重要作用。总之：我们的结果表明：GM130在卵母细胞减数分裂成熟的不同阶段有不同的特异性定位,其定位主要集中分布在生发泡周围、纺锤体的两极和中体及分散于胞浆。这些亚细胞定位可能与GM130所行使的功能有关。GM130在调控纺锤体微管组装、纺锤体极的形成和维持纺锤体的正常形态中起着至关重要的作用,它可能作为一种微管组织中心蛋白监控纺锤体状态或者调控与纺锤体组装相关的蛋白。GM130参与调控卵母细胞的减数分裂中纺锤体的皮质定位、不对称分裂和极体大小。GM130可能参与MAPK信号通路调节纺缍体组装、极体排放及极体大小。本研究分两部分进行：顺式高尔基体基质蛋白GM130调节小鼠卵母细胞纺缍体组装的研究[目的]确定GM130对小鼠卵母细胞纺缍体组装的影响。[研究方法]卵子的收集和培养本实验采用4-6周龄ICR品系雌性小鼠,断颈法快速处死小鼠后取出卵巢,盛于一次性培养皿中,用刀片将卵巢剁碎,释放出来停留在第一次减数分裂间期的未成熟卵母细胞。只将那些处于GV期的未成熟卵母细胞置于转移至M2培养滴中,清洗5-6次后,移至覆盖有矿物油的M2培养滴或者含有2.5μM milrinone的M2培养滴,置于培养箱中培养(37℃,5%CO2,95%湿度)。培养到不同时期后取出用于免疫印迹,免疫荧光及药物处理。免疫荧光及激光共聚焦显微镜检测卵母细胞放入含4%多聚甲醛的PBS中室温30分钟。在室温下0.5%TritonX-100透膜20分钟,卵母细胞采用添加1%BSA的PBS封闭1小时,然后加入1：100的鼠抗GM130抗体,1：200的兔抗P—MEK1/2抗体,1：200兔抗a-tubulin抗体或1:100 anti-a-tubulin-FITC抗体放入4℃冰箱过夜。第二天采用含0.1%Tween 20和0.01%Triton X-100的PBS中洗三次,每次5分钟。卵母细胞在室温下标记上1：100的FITC/TRICT/CY5羊抗兔IgG,或1：100的FITC/TRICT/CY5羊抗鼠IgG 1小时。之后采用HOE或PI标记8—15分钟,再洗三次。最后卵母细胞移到载玻片上采用激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM 510 META)检测。每组实验最少重复三次,每组至少检测50个卵母细胞。免疫印迹收集待检测的卵子约200个,加入等体积2×SDS loading buffer置于沸水中5分钟,冰上冷却后瞬时离心,存于冰上或-20℃。微量进样器上样,恒压90V电泳至样品位于浓缩胶边缘,改为恒压120V电泳2.5小时；4℃条件下转膜,恒流200mA 2.5小时,蛋白转至硝酸纤维素膜；TBS (20mM Tris,137mM NaCl, pH7.4)清洗膜三次,每次10分钟；膜转至封闭液中(5%脱脂奶粉/TBST)室温放置1.5小时；TBST (10mM Tris,150mM NaCl,0.05% Tween 20, pH7.5)清洗三次,每次10分钟；膜移至封闭液稀释的一抗中4℃放置过夜；TBST清洗三次,每次10分钟；膜移至封闭液稀释的二抗中37℃放置1小时；TBST清洗三次,每次10分钟；SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate kit (Thermo)检测信号。重复标记时,膜移至洗脱液(p-mercaptoethanol 14.3M,2% SDS,62.5mM Tris, pH6.7)中50℃放置30分钟,依照上述方法重新与相应的一抗、二抗孵育。本实验涉及到的抗体采用的效价如下：鼠抗GM1301：1000,鼠抗Myc 1：1000,鼠抗P-actin 1:1000,抗鼠IgG 1：1000。Nocodazole处理卵子用M2培养基稀释Nocodazole至20μg/ml,待卵子发育至特定时期后,移至含Nocodazole的M2培养滴,于培养箱中处理10分钟。处理之后,将卵母细胞彻底洗净用于免疫荧光实验。对照组中卵母细胞用相同浓度的DMSO进行处理。Morpholino注射Morpholino是经过修饰的人工合成反义寡核苷酸链小分子,与目的基因的mRNA或/和DNA结合,特异性抑制基因的转录或/和翻译,可作为研究基因功能的小分子工具。本实验所用的morpholino购自GENE TOOLS公司,GM130-morpholino序列信息如下：5’-GGGCCACATCACCACGATCCCGGCA-3’; Control-morpholino序列信息如下：5’-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3’。用Sigma水稀释,工作浓度为2mM和4mM。注射5-10pl的2mM MO后卵母细胞在含2.5μM的Milrinone中培养21小时。新鲜M2培养液中洗5遍,移到新鲜M2培养液中继续培养8小时和12小时,收集这两个时段的卵母细胞固定后做荧光免疫共聚焦试验。[结果]小鼠卵母细胞减数分裂过程中GM130的表达和亚细胞定位体外培养小鼠卵母细胞0小时、2小时、8小时、12小时分别对应其发育的GV、GVBD、MⅠ、MⅡ期,用免疫印迹法半定量检测其表达水平。结果显示在小鼠卵母细胞发育的各个时期均有GM130的表达。为了检测GM130在小鼠卵母细胞发育不同时期的亚细胞定位我们采用了免疫荧光法。在GV期GM130散在分布于胞浆,似乎在生发泡的周围稍有集中。生发泡破裂后,GM130在细胞中央部分聚集。MI前期,染色体排列成一条线之前,GM130就开始向纺缍体的两极集中了。到了第一次减数分裂中期(MI),可以明显地看到GM130主要聚集在纺缍体的两极。当卵母细胞发育到了第一次减数分裂的后末期,GM130在中体的部位聚集。到了MII期,GM130又重新定位到纺缍体的两极,外形象月牙。GM130定位于小鼠卵母细胞纺缍体两极这一现象促使我们去思考,是否GM130与其它的中心体相关蛋白如p-MEK1/2共定位?我们的研究表明在MI和MII期,GM130的信号与p-MEK1/2相重叠。这进一步证实了,GM130在两极定位的现象。诺考达唑处理后GM130的定位我们用了微管解聚药物诺考达唑处理小鼠MI卵母细胞,以明确GM13与微管动力的关系。在MI期,当把20μg/ml的诺考达唑加入培养液处理10分钟,可以发现纺缍体微管已完全解聚,GM130的定位也发生了变化,重新分散分布于胞浆。当药物被完全洗去之后,微管又开始组装成纺缍体,这时GM130也又开始在纺缍体的两极聚集降调GM130对MI期纺缍体组装的影响为了进一步明确GM130在小鼠卵母细胞发育过程中的作用,我们用了GM130的特异性反义寡核苷酸MO注射。免疫印迹和柱状分析图显示通过MO注射后,GM130的表达水平明显下降了。GV期的卵缍母细胞注射MO后在含有2.5mM的米力侬的M2培养液中抑制21小时,然后释放,转移到M2培养液中继续培养,8小时后收集MI期卵子。在GM130 MO注射组,卵母细胞出现了各种形态异常的纺缍体,其中最主要的形态缺陷为拉长纺缍体约(55%,n=120),其它类型的异常纺缍体包括：无极,单极,多极,和未组装好的纺缍体(即有星体微管及胞质星体)GM130 MO注射组不正常纺缍体的比例为(80.5,n=154),明显高于对照组,P<0.05。降调GM130的表达导致γ-tubulin和Plk1从纺缍体的两极脱落从上面的结果我们可以推断GM130参与了纺缍体的组装和极的聚集。我们以前的研究表明,在小鼠卵母细胞减数分裂中,中心体蛋白γ-tubulin和中心体相关蛋白Plkl,是微管组装和纺缍体形成的重要调节因子。通过MO注射降调GM130的表达,我们发现y-tubulin和Plk1的定位也受到了影响。它们均从纺缍体的两极脱落下来了,散落在缍缍体微管上或胞浆中。[结论]在小鼠卵母细胞减数分裂过程中,GM130参与了微管的组装,并且可能是作为一种微管组织中心相关蛋白,与其它中心体相关蛋白相互作用共同调节纺缍体的组装。二、GM130调节小鼠卵母细胞MI期纺缍体迁移及不对称分裂的研究[目的]确定GM130对小鼠卵母细胞纺缍体迁移及减数不对称分裂的影响。[研究方法]卵子的收集和培养、免疫荧光及激光共聚焦显微镜检测与第一部分相同。Morpholino和β5-tubulin-GFP mRNA联合注射Morpholino是经过修饰的人工合成反义寡核苷酸链小分子GM130-morpholino序列信息如下：5’-GGGCCACATCACCACGATCCCGGCA-3’; Control-morpholino序列信息如下：5’-CCTCTTACCTCAgTTACAATTT ATA-3’。用Sigma水稀释,工作浓度为4mM。通过注射5-10pl的4mM MO和同体积的β5-tubulin-GFP mRNA的混和物。然后卵母细胞在含2.5μM的Milrinone中培养21小时。新鲜M2培养液中洗5遍,移入至含有10nM Hoechst33342的M2培养液中放到活细胞工作站继续培养12小时左右,并实时动态观察其变化。注射过程中GV期卵子均置于2.5μM milrinone-M2培养基中,30分钟内完成操作。卵母细胞的活细胞动态观察试验为了追踪纺缍体在降调了GM130的卵母细胞内的动态变化,我们向卵母细胞中注射μ5-tubulin-GFP mRNA和GM130 MO混合物,每个卵母细胞大约注射10pL。经注射的卵母细胞培养至GVBD后放置Perkin Elmer precisely Ultra VIEW VOX活细胞共聚焦成像系统,继续培养12小时左右。我们使用了窄带通滤波器和一个绿色荧光蛋白30%的削减中性密度日色度过滤器。根据tubulin-GFP的荧光强度,曝光时间在300毫秒到800毫秒之间。用IP Lab (Scanalytics)或AQM6 (Andor/Kinetic-imaging)的软件系统支持数字化的延时成像技术。U0126处理卵子浓储的U0126 (10 mM; Calbiochem, La Jolla, CA)溶解于二甲亚砜(DMSO)。保存于4℃,在细胞培养1小时前才被稀释、添加到培养液中。终浓度为50μM。GV期的卵母细胞在含有50μM的U0126的M2培养液中培养至MI期,用于免疫荧光试验。对照组中卵母细胞用相同浓度的DMSO进行处理。[结果]降调GM130的表达导致极体排出率降低,大极体排出率增加GV期的卵缍母细胞注射MO后在含有2.5mM的米力侬的M2培养液中抑制21小时,然后释放,转移到M2培养液中继续培养,16小时后收集MII期卵子。我们注意到在GM130 MO组的卵母细胞排出的极体大部分为不正常的大极体,有些大极体内还包含了个正常形态的纺缍体,也有很多卵母细胞阻滞在MI期。GM130 MO注射组极体排出率为(49.4%,n=154),明显较对照MO注射组(79.5%,n=161)低,P<0.05。而且,排出的极体大部分为大极体(60.5%,n=76)与对照组相比差异有显著性(5.5%,n=128)。降调GM130影响了小鼠卵母细胞不对称分裂的现象引起了我们的注意。卵母细胞成熟过程中的纺锤体迁移和不对称定位依赖肌动蛋白细胞骨架。纺锤体的不对称定位,或更准确地说是纺锤体中的染色体能在相邻的皮质区诱导微丝帽的形成。为了研究降调GM130是否影响微丝帽的形成,我们分析GVBD后7小时和14小时的卵母细胞相当于处于胞质分裂期和停滞在MII期的卵细胞。对照组卵母细胞在排出极体前(GVBD后7h)可见非常明显的微丝帽及与之相邻的MI染色体,相比而言,GM130 MO注射组的MI期阻滞的卵母细胞的染色体则位于卵母细胞中央,且皮质区缺乏微丝帽。过夜培养后(相当于GVBD后14小时)我们发现BFA GM130 MO处理产生的两个大小相似的卵细胞全部出现微丝帽(14/14),而且所有微丝帽都位于两个卵细胞连接处；在这些卵细胞中,MII染色体总是位于微丝帽附近。在GM130 MO处理的没有极体排出的卵母细胞中有40%的卵(7/16))没有微丝帽存在,而60%(9/16)具有微丝帽。上述表型的出现分别与MII染色体在卵细胞中央或临近皮质区相关。因此微丝帽的形成对GM130的降调不敏感；它是由纺缍体的不对称定位(更准确地说是由染色体的位置)所控制的。GM130 MO处理的卵母细胞胞质分裂时缺乏微丝帽说明没有发生纺锤体不对称定位。降调GM130的表达影响小鼠卵母细胞的不对称分裂为了进一步深入研究降调GM130后引起的卵母细胞的缺陷,我们向卵母细胞内注射了β5-tubulin-GFP mRNA和GM130 MO或对照MO的混合物,并应用了活细胞工作站延时拍摄系统去捕捉纺缍体的动态变化。结果显示：对照组卵母细胞在GVBD后约4小时纺缍体开始形成,并迅速迁移到皮质区,大约在GVBD后9小时排出第一极体。而在β5-tubulin-GFP mRNA和GM130 MO混合注射组,我们发现了各种形态异常的纺缍体。纺缍体也是在GVBD后约4小时开始形成,但是在GVBD后7小时很多仍位于细胞中央,没有迁移。我们展示了典型的排大极体及没有极体排出的卵子的纺缍体的动态变化,纺缍体在GVBD后约7小时开始拉长,远侧的极开始向临近的皮质区延伸,随后形成卵裂沟,大极体排出。而在没有极体排出的卵母细胞,纺缍体也在GVBD后约7小时开始拉长,但是极不能到达皮质,卵裂沟不能形成。为了定量地描述GM130 MO注射对卵母细胞纺缍形成和迁移造成的影响,我们实时测量了纺缍体的长度(S)以及纺缍体与远侧皮质区临近的极到该皮质区的距离(D)。在对照组卵母细胞,纺缍体的迁移是整体移动的,它的长度基本不变,即便是在第一次减数分裂的后末期也没被拉长。三组卵母细胞的纺缍体开始形成的时间无差异,大约都在GVBD后4小时。然而,在GVBD后7小时,GM130 MO注射组,纺缍体单极拉长,较对照组有明显差异。在GM130MO注射组,当纺缍体极度拉长(约为原来的1.6倍),纺缍体的极接近皮质，卵母细胞排出第一极体。如果纺缍体拉长不足以达到皮质区,则卵母细胞停留在MI期,不能排出极体。GM130 MO注射组的卵母细胞在第一次减数分裂后末期,纺缍体不能迁移,仅单极拉长的现象吸引了我们的注意。我们测量了纺缍体极一皮质的距离,对照组细胞在分裂的后末期逐渐增加,而在GM130 MO注射组,这一距离却基本保持不变。用U0126或GM130—MO处理卵母细胞分别影响GM130或p-MEK在纺缍体两极的定位我们以前的研究已表明p-MEK1/2在小鼠卵母细胞微管组装及极体排放中有重要的调节作用,降调p-MEK1/2的表达会导致MI纺缍体的拉长,大极体的形成。降调GM130,也出现了类似的现象,这就促使我们思考,是否GM130与p-MEK1/2之间存在着某种关联?在对照组MI期的卵母细胞中,GM130和p-MEK1/2均定位于纺缍体的两极。使用MEK的抑制剂U0126则会使影响GM130在纺缍体的两极的定位,使其散在分布于胞浆；而降调GM130则会导致p-MEK1/2从纺缍体的两极脱落,分布于纺缍体微管上。[结论]GM130可能是影响小鼠卵母细胞纺缍体的迁移的直接因素并可能参与了MAPK信号通路去调节纺缍体的组装及减数不对称分裂。
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