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放射敏感性肿瘤自杀基因载体对鼻咽癌杀伤作用的研究

作　者: 姜武忠
导　师: 赵素萍
学　校: 中南大学
专　业: 耳鼻咽喉科学
关键词: Egr-1启动子 CD自杀基因 hTERT启动子 Survivin反义寡核苷酸链鼻咽癌基因治疗
分类号: R739.63
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的鼻咽癌为鼻咽部常见的恶性肿瘤，发病年龄较其他恶性肿瘤年龄偏低，多为30～50岁，鼻咽癌发病率以中国南方地区较高。在中国有资料表明其占全身肿瘤的18～30％，占头颈部肿瘤的78％。目前鼻咽癌的常规治疗方法主要是放疗和化疗，本研究拟构建一个新型的具有放射敏感性和肿瘤特异性的鼻咽癌基因治疗载体，以期利用双重协同杀伤作用以降低放疗射线和化疗药物的剂量，提高特异杀伤肿瘤的效果。方法采用PCR方法扩增早期生长反应因子1(Egr-1)启动子、胞嘧啶脱胺酶(CD)自杀基因、人端粒酶亚基(hTERT)启动子、凋亡抑制因子存活素(Survivin)反义寡核苷酸链；通过酶切连接分别构建成pcDNA3.1-Egr-CD(简写为pEC)、pcDNA3.1-hTERT-Survivin(简写为pTS)、pcDNA3.1-Egr-CD-hTERT-Survivin(简写为pEC-TS)真核表达载体。采用电转、脂转等方法分别将各基因载体转染CNE-2细胞，在经放射线照射以及前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)处理后，用RT-PCR检测和比较CD、Survivin基因的表达，并通过高效液相色谱(HPLC)检测前体药物5-FC转化成瘤内毒性药物5-FU的转化效率；并通过Hoechest33258细胞核染色观察实验处理后的细胞凋亡情况，同时通过单核细胞直接细胞毒性测定(MTT)在体外比较上述载体的杀瘤效果。最后通过建立裸鼠动物模型进行体内实验，设定相关对照，检测瘤体经实验处理后的体积变化以及病理特征改变，据此比较出最具杀瘤效果的载体。结果酶切证实pEC、pTS、pEC-TS真核表达载体构建成功；并通过转染人皮肤成纤维细胞HDF和CNE-2细胞，检测了hTERT启动子在端粒酶阳性细胞特异性调控基因表达的特性；各载体分别转染CNE-2细胞，在经放射线照射和5-FC处理后，用RT-PCR检测发现用pEC、pEC-TS转染的CNE-2细胞中CD有效表达，HPLC检测到前体药物5-FC转化成5-FU；pTS、pEC-TS转染的CNE-2细胞中则检测到Survivin基因表达明显降低；pEC-TS实验组明显观察到经Hoechest33258染色后出现大量凋亡细胞；MTT试验结果也显示pEC-TS组的杀瘤效果与其他实验组相比较有显著的统计学差异(p＜0.05)；裸鼠动物模型测定到pEC-TS组能明显抑制肿瘤的生长，且与其它各组相比较，均有显著性差异(p＜0.05)。病理结果相应显示大量肿瘤细胞死亡。结论在CNE-2细胞转染pEC-TS载体后，放射线的照射使Egr-1启动子有效启动了CD基因的表达，并将5-FC转化成5-FU，同时hTERT启动子调控的Survivin反义寡核苷酸链特异性降低Survivin基因表达，提高了CNE-2肿瘤细胞对5-FU的敏感性；从而使其体外的抑瘤率达43％，体内显著抑制肿瘤生长，因此该载体极具应用潜质，也为鼻咽癌的基因治疗提供了一种新的思路。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
英文简略词  9-11
主要仪器和试剂  11-13
论文正文  13-50
  前言  13-16
  第一章放射敏感自杀基因治疗载体的构建  16-34
    1.1 材料  17-18
    1.2 方法  18-27
    1.3 实验结果  27-34
  第二章自杀基因载体对体外鼻咽癌细胞杀伤效果的研究  34-43
    2.1 材料  35
    2.2 实验方法  35-40
    2.3 实验结果  40-43
  第三章放射敏感自杀基因治疗载体功能研究—动物实验  43-50
    3.1 材料  43
    3.2 方法  43-46
    3.3 实验结果  46-50
讨论  50-54
总结  54-55
参考文献  55-58
综述  58-81
致谢  81-82
攻读学位期间主要成果  82-83

放射敏感性肿瘤自杀基因载体对鼻咽癌杀伤作用的研究

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