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牛和小鼠卵母细胞体外成熟培养

作　者: 王昭晖
导　师: 吴民耀
学　校: 陕西师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 牛小鼠卵母细胞成熟培养
分类号: Q813.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

卵母细胞体外成熟培养(in vitro maturation, IVM)是从供体动物的卵巢中获取卵母细胞,在适宜的条件下进行培养至成熟。IVM目的在于获取大量成熟的卵母细胞,IVM是成功进行体外受精的关键,也是动物转基因的一项基础技术。尽管卵母细胞在体外能自发成熟,但卵母细胞的成熟质量与成熟率却远不如体内成熟的卵母细胞,体外培养的卵母细胞受精后的胚胎发育能力较差。造成体外培养卵母细胞成熟率低的原因有很多：供体动物所处的发育阶段、卵丘细胞的层数、注射激素的时间、基础培养液的种类以及所添加激素和生长因子的种类和剂量。深入了解卵母细胞的成熟规律的基础是建立一套完善的卵母细胞体外培养系统。牛卵母细胞体外成熟培养有重要的经济和实践意义,而小鼠作为一种模式生物,其卵母细胞体外成熟培养是哺乳动物卵母细胞体外成熟研究的最常用和最经济的重要模式。目的：在本研究中,对牛和小鼠卵母细胞体外成熟培养条件进行了探讨,系统地研究了影响牛和小鼠卵母细胞体外成熟培养的各种因素,并比较小鼠人工裸卵(denuded oocytes, DO)和卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes COCs)在相同培养条件下的成熟的能力。方法与结果：1.从屠宰场取牛的卵巢,用抽吸法、切割法、抽吸法加切割法获取牛卵母细胞,结果发现抽吸法加切割法是获取牛卵母细胞的最佳方法。2.对小鼠激素刺激,收集卵母细胞并记录各级卵母细胞的数量,发现在进行小鼠卵母细胞体外成熟培养前,对小鼠进行激素刺激是必要的。3.对小鼠进行PMSG和hCG激素刺激,在第12h、24h、36h、48h后收集卵母细胞并进行体外培养,比较24h后的成熟率,发现延长PMSG的作用时间,对卵母细胞的成熟无显著的促进作用,而延长hCG的作用时间,可以显著促进小鼠卵母细胞的成熟。4.用M2、DMEM和M 199做基础培养液并添加10%FBS,对B级卵母进行培养,结果表明小鼠卵母细胞体外培养的理想基础培养液是M199。5.获取经激素PMSG刺激小鼠的A、B、C级卵母细胞并制备DO(人工裸卵),使用M199+10%FBS成熟培养液进行体外培养,结果表明B级卵母细胞和人工裸卵的成熟潜力显著优于A、C级卵母细胞。6.培养A、B级卵母细胞,每隔4小时观察卵丘扩展情况并统计各级卵丘扩展的百分率,在培养过程中发现卵丘-卵母细胞的成熟伴随着卵丘的扩散,而卵丘-卵母细胞的成熟不需要卵丘的完全扩散。7.收集小鼠体内GV期COC,一部分直接用于培养,另一部分制得DO用于体外培养,每隔2小时观察并统计生发泡破裂率(GVBD%)和第一极体排出率(PBI%)直到24小时,结果发现在小鼠卵母细胞体外培养的4-10小时,大量的卵母细胞发生GVBD,PBI主要发生在8-14小时,并且COC和DO的成熟有同步性。8.以M199为基础培养液,以0IU/mL、0.5IU/mL、1.0IU/mL、1.5IU／mL、2.0IU／mL浓度组添加FSH,体外培养若干小时后,统计GVBD%和PBI%.结果表明FSH能促进卵丘-卵母细胞复合体的成熟,而对裸卵的成熟无促进作用,并且所选的浓度对卵丘一卵母细胞复合体促进成熟的作用相似。9.以M199为基础培养液,以0IU／mL、0.5IU/mL、1.51U/mL、2.0IU/mL浓度组添加LH,分别培养COC与DO,体外培养若干小时后,统计GVBD%和PBI%,结果表明,LH存在时卵丘颗粒细胞对卵母细胞成熟有促进作用,1.5IU/mL-2.0IU/mL的LH对小鼠卵母细胞体外成熟有显著的促进作用。10.以M199为基础培养液,以Ong/mL、20ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL浓度组添加EGF,分别培养COC与DO,体外培养若干小时后,统计GVBD%和PBI%,结果表明,40ng／mL的EGF能促进裸卵与卵丘-卵母细胞复合体的成熟。11.以M199为基础培养液,以Ong/mL、5ng/mL、50ng/mL、500ng/mL、10000ng/mL浓度组添加E2,分别培养COC与DO,体外培养若干小时后,统计GVBD%和PBI%,结果表明,50ng／mL的E2可促进小鼠卵母细胞体外成熟,而高浓度的E2抑制COC第一极体的排出。12.收集培养24小时后的COC、GC(granulosa cells,颗粒细胞)和DO,RT-PCR检测GDP-9和BMP-15基因的表达,结果表明,体外培养24小时后,COC的BMP-15表达量比DO弱,COC和DO表达GDF-9的量相似,而GC表达GDF-9的量较弱。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
第1章综述  12-23
  1.1 卵母细胞的生长发育  12-13
  1.2 卵母细胞成熟过程中细胞器的变化  13-14
    1.2.1 细胞核的变化  13
    1.2.2 皮质颗粒的变化  13
    1.2.3 透明带和细胞质膜的变化  13-14
  1.3 诱导超数排卵  14-15
  1.4 卵丘细胞与卵母细胞成熟的关系  15-16
    1.4.1 卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中的作用  15
    1.4.2 卵丘扩展与卵母细胞发育潜力的关系  15-16
    1.4.3 卵丘细胞的层数对卵母细胞体外成熟的影响  16
  1.5 影响卵母细胞体外成熟的激素和生长因子  16-19
    1.5.1 FSH对卵母细胞体外成熟的影响  16-17
    1.5.2 LH对卵母细胞体外成熟的影响  17
    1.5.3 EGF对卵母细胞体外成熟的影响  17-18
    1.5.4 E2对卵母细胞体外成熟的影响  18-19
  1.6 影响卵母细胞成熟的其他因素  19-20
    1.6.1 气相环境与湿度  19
    1.6.2 培养时间  19
    1.6.3 成熟培养液  19-20
    1.6.4 血清  20
  1.7 卵母细胞成熟质量的评价  20-21
    1.7.1 GSH含量评价方法  21
    1.7.2 体外受精、体外胚胎评价方法  21
  1.8 小鼠卵母细胞成熟培养中GDF-9和BMP-15的表达  21-23
第2章牛卵母细胞体外成熟培养的研究  23-28
  2.1 试剂与仪器  23-24
    2.1.1 主要仪器及设备  23
    2.1.2 主要试剂  23
    2.1.3 主要操作液  23-24
  2.2 实验方法  24-25
    2.2.1 牛卵巢的采集、运输  24
    2.2.2 牛卵母细胞的采集  24
    2.2.3 牛卵母细胞的分级  24-25
    2.2.4 玻璃采卵针的制作和微滴培养  25
    2.2.5 体外培养的牛卵母细胞成熟判断  25
  2.3 实验结果  25-26
    2.3.1 牛卵母细胞的采集  26
    2.3.2 牛卵母细胞的体外培养  26
  2.4 讨论  26-28
    2.4.1 牛卵母细胞的采集  26-27
    2.4.2 牛卵母细胞的体外培养过程中的观察  27-28
第3章小鼠卵母细胞体外成熟培养的研究  28-69
  3.1 试剂与仪器  28-29
    3.1.1 主要仪器及设备  28
    3.1.2 主要试剂  28
    3.1.3 主要操作液  28-29
    3.1.4 主要实验耗材  29
  3.2 实验方法  29-32
    3.2.1 实验动物和激素超排处理  29
    3.2.2 小鼠卵母细胞的采集  29-30
    3.2.3 小鼠卵母的分级?  30
    3.2.4 玻璃采卵针的制作和微滴培养  30
    3.2.5 体外培养的小鼠卵母细胞成熟判断  30
    3.2.6 地衣红染色  30-31
    3.2.7 主要溶液的配制  31-32
  3.3 实验步骤  32
  3.4 数据统计  32-33
  3.5 实验结果  33-61
    3.5.1 激素刺激对小鼠采卵数量及类型的影响  33-34
    3.5.2 小鼠卵母细胞的体外培养过程中的观察  34
    3.5.3 激素刺激的处理时间对卵母细胞体外成熟的影响  34-35
    3.5.4 不同培养液对卵母细胞成熟的影响  35-36
    3.5.5 不同类型卵母细胞成熟能力的比较  36
    3.5.6 卵丘扩散与卵母细胞成熟的关系  36-37
    3.5.7 COC与DO体外成熟的比较  37-40
    3.5.8 FSH对DO和COC体外成熟培养的影响  40-45
    3.5.9 LH对DO和COC体外成熟培养的影响  45-50
    3.5.10 EGF对DO和COC体外成熟培养的影响  50-56
    3.5.11 E2对DO和COC体外成熟培养的影响  56-61
  3.6 讨论  61-69
    3.6.1 激素刺激对小鼠采卵数量及类型的影响  61
    3.6.2 激素刺激的处理时间对卵母细胞体外成熟的影响  61-62
    3.6.3 不同培养液对卵母细胞成熟的影响  62
    3.6.4 不同类型卵母细胞的成熟潜力的比较  62-63
    3.6.5 卵丘扩散与卵母细胞成熟的关系  63
    3.6.6 COC与DO的体外成熟的比较  63-64
    3.6.7 FSH对DO和COC体外成熟培养的影响  64-65
    3.6.8 LH对DO和COC体外成熟培养的影响  65-66
    3.6.9 EGF对DO和COC体外成熟培养的影响  66-67
    3.6.10 E2对DO和COC体外成熟培养的影响  67-69
第4章小鼠卵母细胞成熟培养中GDF-9和BMP-15的表达  69-74
  4.1 仪器与试剂  69
    4.1.1 主要仪器及设备  69
    4.1.2 主要试剂  69
    4.1.3 主要溶液的配制  69
  4.2 实验方法  69-72
    4.2.1 卵母细胞总RNA的提取及纯化  69-70
    4.2.2 设计引物  70
    4.2.3 反转录cDNA链的获得  70-71
    4.2.4 PCR产物凝胶电泳  71-72
  4.3 实验结果  72-73
    4.3.1 RNA完整性检测  72
    4.3.2 小鼠卵母细胞成熟培养中GDF-9和BMP-15的表达  72-73
  4.4 讨论  73-74
第5章结论  74-75
参考文献  75-83
附录  83-89
致谢  89-90
发表论文情况  90

牛和小鼠卵母细胞体外成熟培养

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