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Leptin和GDNF对小鼠卵母细胞成熟的旁分泌调节机制

作　者: 叶英辉
导　师: 黄荷凤；河村和弘
学　校: 浙江大学
专　业: 妇产科
关键词: 卵母细胞 卵丘细胞 颗粒细胞 生殖泡破裂 第一极体释放 胞浆成熟旁分泌 瘦素 胶质细胞来源的神经营养因子
分类号: R714.8
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


目的探讨瘦素和胶质细胞来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophicfactot,GDNF)是否有通过旁分泌机制调节卵母细胞成熟的可能。材料和方法1.DNA基因芯片分析鼠龄为21天的雌性B6D2F1小鼠,每只注射7.5单位Humegon促卵泡发育。48小时后,部分小鼠每只注射5单位Pregnyl诱发排卵。取卵巢提取RNA,然后与Affymetrix的小鼠MGU74v2芯片A,B,C杂交。2.实时荧光定量PCR检测瘦素和GDNF以及受体在hCG作用后变化情况。3.免疫组织化学研究生长因子(瘦素和GDNF)在卵巢各细胞中的表达。4.采用卵泡培养研究瘦素和GDNF对小鼠卵母细胞生殖泡破裂(germinal vesiclebreakdown,GVBD)的作用。5.对卵-卵丘复合物(COCs)和裸卵进行培养,研究瘦素和GDNF对小鼠卵母细胞第一极体释放的作用。6.采用体外成熟-采用体外受精-胚胎培养研究瘦素和GDNF对小鼠卵母细胞胞浆成熟的作用。结果1.基因芯片结果显示:hCG刺激后,小鼠卵巢瘦素的mRNA表达量变化不明显,但受体表达量显著上升。与瘦素结果不同,hCG刺激后,GDNF及其受体的表达量均明显上升。2.与基因芯片的结果基本一致,注射hCG后,瘦素的表达量改变不明显;Ob-Ra的表达量显著上升,Ob-Rb的表达量也有所上升,但不如Ob-Ra显著。GDNF及其受体Gfral的mRNA表达量均显著上升。在卵巢各细胞组分中,小鼠卵母细胞Ob-Ra的mRNA水平在注射hCG后显著上升,而Ob-Rb的mRNA水平无明显变化。小鼠卵母细胞的GDNF mRNA水平几乎检测不到。hCG作用后,卵丘细胞和壁层颗粒细胞的GDNF,Gfral和Ret mRNA水平显著上升,而卵母细胞的Gfral和Ret mRNA水平无明显变化。3.免疫组化结果:瘦素在卵细胞、卵泡膜细胞和间质细胞中呈强阳性表达;在排卵前卵泡的颗粒细胞和卵丘细胞中也呈阳性,窦前卵泡和小卵泡的颗粒细胞瘦素蛋白表达呈阴性。GDNF蛋白在排卵前卵泡的卵丘细胞、靠近卵泡腔的壁层颗粒细胞和卵泡膜细胞中表达呈阳性,小卵泡的GDNF蛋白表达呈阴性。4.体外培养条件下添加瘦素能促进小鼠卵母细胞GVBD的发生和第一极体释放,而MEK 1/2抑制剂能阻断这种促进作用。体外培养中添加GDNF能促进小鼠卵母细胞第一极体释放,但对GVBD无明显影响。5.在体外成熟培养阶段添加瘦素能促使MⅡ期卵母细胞的受精率和囊胚形成率增加。在IVM阶段添加GDNF对MⅡ期卵母细胞的受精率和囊胚形成率无明显影响。结论1)LH/hCG能使小鼠卵母细胞的Ob-Ra表达量增加。小鼠卵巢的卵丘细胞、壁层颗粒细胞和卵泡膜细胞产生瘦素。2)体外培养条件下,瘦素能促进小鼠卵母细胞GVBD的发生和第一极体的释放,而且,Ob-Ra/MEK 1/2信号传导系统参与介导了瘦素对小鼠卵母细胞核成熟的促进作用。体外成熟过程中添加瘦素能促进卵母细胞胞浆成熟。3)小鼠卵巢的卵丘细胞,壁层颗粒细胞产生GDNF,并且受到LH/hCG的调节。4)在体外培养条件下,GDNF能促进小鼠卵母细胞的第一极体释放。但对GVBD和胞浆成熟无影响。

全文目录


致谢  5-6
序言(前言)  6-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
缩写、符号清单、术语表  13-14
目次  14-16
第一部分:促性腺激素对小鼠卵巢中瘦素和GDNF及其受体表达的调节  16-40
  1 前言  16-18
  2.材料与方法  18-25
    2.1 DNA基因芯片分析  18
    2.2 实时荧光定量PCR  18-24
    2.3 免疫组织化学  24-25
    2.4 ELISA  25
    2.5 统计分析  25
  3 结果  25-30
    3.1 基因芯片结果  25-27
    3.2 实时定量PCR和ELISA对基因芯片结果的验证  27-30
    3.3 瘦素和GDNF在卵巢中定位的免疫组化研究  30
  4 讨论  30-36
  5 结论  36-37
  参考文献  37-40
第二部分:瘦素对小鼠卵母细胞核成熟和胞浆成熟的促进作用  40-58
  1 前言  40-41
  2.材料与方法  41-45
    2.1 动物  41
    2.2 实时荧光定量PCR  41-43
    2.3 卵泡培养  43
    2.4 COCs或裸卵培养  43-44
    2.5 体外成熟-体外受精-胚胎培养  44
    2.6 统计分析  44-45
  3 结果  45-50
    3.1 促性腺激素对小鼠卵泡各细胞组分的瘦素以及受体mRNA表达量的调节  45-47
    3.2 瘦素对小鼠卵母细胞核成熟的作用  47-49
    3.3 瘦素通过MEK 1/2信号传导系统促进卵母细胞核成熟  49
    3.4 瘦素对小鼠卵母细胞胞浆成熟的作用  49-50
  4 讨论  50-53
  5 结论  53-54
  参考文献  54-58
第三部分:GDNF对小鼠卵母细胞第一极体释放的促进作用  58-73
  1 前言  58-59
  2.材料与方法  59-60
    2.1 动物  59
    2.2 实时荧光定量PCR  59
    2.3 卵泡培养  59
    2.4 COCs或裸卵培养  59
    2.5 COCs培养以及免疫印迹  59-60
    2.6 体外成熟-体外受精-胚胎培养  60
    2.7 统计分析  60
  3 结果  60-66
    3.1 促性腺激素对小鼠卵泡各细胞组分的GDNF以及受体mRNA表达量的调节  60-62
    3.2 GDNF对小鼠卵母细胞核成熟的作用  62-65
    3.3 GDNF对小鼠卵母细胞胞浆成熟的作用  65-66
  4 讨论  66-69
  5 结论  69-70
  参考文献  70-73
综述  73-94
  参考文献  83-94
作者简历  94-95

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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学
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