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石蒜属植物小鳞茎繁殖及基于转录组学的基因发掘研究

作　者: 常乐
导　师: 夏宜平
学　校: 浙江大学
专　业: 观赏园艺学
关键词: 石蒜属资源扦插组织培养诱变转录组差异表达基因
分类号: S682.29
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

石蒜属(Lycoris)植物是我国原产的重要球根花卉资源,分布范围广,适应性和抗逆性强,又具有很高的观赏价值和药用价值,是切花、盆栽、园林地被植物的常用材料。然而,由于石蒜鳞茎的生长周期长、自然繁殖系数低等限制因素,目前难以达到规模化生产和产业化开发的要求,大量挖掘野生资源的现状,导致资源保护堪忧。如能缩短鳞茎繁育周期,扩大繁殖系数,并改良观赏性状,将对石蒜属植物的资源保护、开发利用具有重要实践意义。本文在对换锦花等石蒜属重要野生资源调查的基础上,通过筛选、优化鳞片扦插繁殖技术和组培小鳞茎诱导技术,以有效缩短鳞茎发育周期,提高繁殖系数；尝试利用化学诱变和辐照诱变手段探讨换锦花的倍性育种。同时,利用目前先进的高通量测序技术,从RNA水平建立了换锦花的转录组数据库,获得大规模基因信息,对其基因功能进行预测,并在此基础上比较幼年期鳞茎与成熟鳞茎的差异表达基因及其功能,以发掘与鳞茎发育、代谢途径相关的基因,为石蒜属植物的分子育种奠定重要理论基础。主要研究结果如下：1.实地调查了浙江舟山群岛、南麂列岛和台湾地区马祖列岛,均发现稀少但保存完好的换锦花群落,其野生生境和伴生植物群落存在差异,证实换锦花具有较阔的生态幅,并发现可能存在生态型变异。2.通过对红花石蒜、忽地笑、换锦花等鳞茎进行切分扦插试验,认为四月是江南地区适宜的扦插季节,其鳞茎块的成活率和繁殖系数高；母鳞茎越大,则繁殖力越强。试验发现,四分鳞茎块的气培法是一种稳定、有效的扦插方式,可发生大量整齐而健壮的腋芽,为周年批量培育小鳞茎提供可能。3.针对组培过程中鳞茎块易污染、褐化的普遍问题,比较了不同消毒时间、外植体选择和预处理等方法,提出0.1%升汞的适宜消毒时间,双鳞片诱导、外植体基盘朝上接种和利用幼嫩鳞茎降低污染率和褐化率的有效方法,尤其使用20 mg/L抗坏血酸预处理可有效防止褐化发生。4.创造性地提出利用扦插获得的一年生小鳞茎为外植体进行悬浮培养,其污染率低且出芽大量、迅速；利用内生菌含量极低的未成熟胚为外植体,成功地通过胚挽救手段形成胚根和不定芽。试验筛选出石蒜属植物适宜的初代培养和继代培养培养基,即10 mg/L BA和0.5 mg/L NAA组合的不定芽诱导率最高,8 mg/LBA和1-2 mg/L NAA组合的增殖率较高。5.对换锦花鳞茎进行秋水仙素处理,确定了半致死处理时间为48 h,并经根尖染色体计数、叶表皮气孔保卫细胞大小统计、流式细胞仪DNA相对含量检测,确认获得了二倍体与四倍体嵌合体。利用60co Y射线辐照换锦花鳞茎,多数材料死亡,部分可能有变异产生。6.利用新一代高通量测序技术对换锦花鳞茎进行了大规模转录组测序,共获得98150个基因,其中45.9%的序列经蛋白质数据库比对获得注释。对功能基因进行G0、COG及KEGG分类研究,得知脂氧合酶、α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)、a-海藻糖磷酸合酶等在换锦花鳞茎中表达量最高,与代谢相关的途径、植物-病原互作、剪接、植物激素的生物合成途径等是换锦花最活跃的生物代谢途径。7.利用数字基因表达谱技术(DGE)对换锦花休眠期的多年生成熟鳞茎和一年生幼年期小鳞茎进行测序,由表达量分析及注释结果可知换锦花中有较多基因编码的蛋白质功能未知,并有很多新的基因片段。与换锦花转录组数据库比对,两个发育阶段共存在4389个表达差异显著的基因,其中上调表达基因数多于下调表达基因数,说明大部分基因在换锦花鳞茎发育过程中表达受到抑制。在差异表达基因中,病程相关蛋白上调表达最显著,假想的钙反应转录共激活因子下调表达最显著。利用KEGG数据库以及转录组参考数据库找到7条在差异表达中显著富集的Pathway。这7条途径中,光合作用途径和α-亚麻酸途径全部上调,说明这两个途径在鳞茎发育早期非常活跃。

全文目录

目录  5-9
摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
表目录  13-15
图目录  15-18
前言  18-19
1 文献综述  19-33
  1.1 石蒜属植物分类与资源分布  19-24
    1.1.1 石蒜属植物资源的分类  19-20
    1.1.2 石蒜属植物资源在我国的分布  20
    1.1.3 换锦花资源在我国的分布  20-24
  1.2 石蒜属植物的繁殖  24
    1.2.1 石蒜属植物的繁殖特点  24
    1.2.2 石蒜属植物的繁殖方式  24
  1.3 石蒜属植物再生体系研究进展  24-28
    1.3.1 外植体的选择与处理  25-26
    1.3.2 培养基配制与激素配比  26-28
    1.3.3 其他条件的研究  28
  1.4 石蒜属植物育种研究概况  28-29
    1.4.1 育种研究目标  28-29
    1.4.2 育种成果  29
    1.4.3 石蒜属植物的染色体多倍性  29
  1.5 转录组学研究概述  29-33
    1.5.1 新一代高通量测序技术在转录组学中的应用  29-31
    1.5.2 数字表达谱技术(DGE)研究差异表达基因功能  31-33
2 石蒜属植物鳞片扦插繁育研究  33-43
  2.1 红花石蒜鳞片扦插的小鳞茎发育  33-37
    2.1.1 材料与方法  33-34
    2.1.2 结果分析  34-37
  2.2 忽地笑鳞茎与双鳞片气培法诱芽培养  37-39
    2.2.1 材料与方法  37
    2.2.2 结果分析  37-39
  2.3 植物生长延缓剂对小鳞茎形成的影响  39-41
    2.3.1 材料与方法  39-40
    2.3.2 结果分析  40-41
  2.4 小结与讨论  41-43
3 石蒜属植物离体再生培养条件的优化  43-59
  3.1 外植体处理方式对防止污染和褐化的影响  43-49
    3.1.1 消毒时间和预处理对外植体的影响  43-46
    3.1.2 不同鳞茎切割方式对不定芽发生的影响  46-47
    3.1.3 外植体放置方式对不定芽发生的影响  47-49
  3.2 不同外植体材料的选择与处理  49-55
    3.2.1 一年生小鳞茎的固体与液体培养  49-50
    3.2.2 未成熟种子培养  50-53
    3.2.3 蔗糖浓度及培养形式在对脱水种子胚挽救过程中的作用  53-55
  3.3 不同激素配比对不定芽发生和小鳞茎增殖的影响  55-57
    3.3.1 材料与方法  55
    3.3.2 试验结果  55-57
  3.4 小结与讨论  57-59
4 换锦花诱变育种研究初探  59-71
  4.1 秋水仙素诱导换锦花多倍体  59-67
    4.1.1 材料与方法  59-60
    4.1.2 结果分析  60-67
  4.2 ~(60)Coγ射线辐照换锦花鳞茎诱变育种研究  67-69
    4.2.1 材料与方法  67
    4.2.2 结果分析  67-69
  4.3 小结与讨论  69-71
    4.3.1 诱变方式对换锦花多倍体诱导的影响  69-70
    4.3.2 秋水仙素处理半致死时间与辐射剂量  70
    4.3.3 换锦花嵌合体现象与纯合多倍体  70-71
5 基于高通量Illumina GA Ⅱ技术的换锦花转录组测序及分析  71-85
  5.1 材料与方法  73-74
    5.1.1 材料  73
    5.1.2 RNA提取、反转录、文库构建  73
    5.1.3 转录组测序和拼接  73-74
    5.1.4 功能注释、分类和代谢途径分析  74
  5.2 结果与讨论  74-84
    5.2.1 测序产量及组装质量统计  74-75
    5.2.2 蛋白功能注释  75-77
    5.2.3 转录组数据库中高表达量的转录子  77-78
    5.2.4 Gene ontology(GO)、Clusters of orthologous groups(COG)分类  78-81
    5.2.5 代谢途径分析  81-84
  5.3 小结  84-85
6 换锦花成熟鳞茎与子鳞茎的差异表达基因分析  85-105
  6.1 材料与方法  85-87
    6.1.1 材料  85
    6.1.2 数字化基因表达谱(DGE)准备及测序  85-86
    6.1.3 DGE标签的分析及与参考数据库比对  86
    6.1.4 差异表达基因的筛选  86-87
    6.1.5 差异表达基因的功能显著性富集分析  87
  6.2 结果与讨论  87-103
    6.2.1 换锦花鳞茎成熟鳞茎与子鳞茎的DGE测序结果  87-90
    6.2.2 表达谱序列的基因表达注释及表达量统计  90-94
    6.2.3 显著性差异表达基因分析  94-99
    6.2.4 GO功能显著性富集分析  99-102
    6.2.5 Pathway显著性富集分析  102-103
  6.3 小结  103-105
总结、创新点及展望  105-109
参考文献  109-115
攻读学位期间发表的论文  115-116
致谢  116-118

石蒜属植物小鳞茎繁殖及基于转录组学的基因发掘研究

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