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嗜盐嗜热菌新属新种的分离鉴定和三大洋热液区沉积物微生物种群分析

作　者: 刘欣
导　师: 徐洵
学　校: 国家海洋局第三海洋研究所
专　业: 海洋分子生物学
关键词: 深海热液区系统发育 RFLP DGGE 16S rDNA克隆文库
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

微生物是地球上最大的生物资源宝库，深海和温泉微生物作为其一个重要的组成部分，日益成为人们开发利用的焦点。由于生长环境的极端特殊性，使得它们具有无数陆地生物所没有的酶类和其他代谢产物来适应这种对大多数生物来说是难以生存的环境。它们细胞和酶蛋白独特的耐热性和与之相适应的分子结构，使之成为了人们开发利用的重要生物资源和科学研究的重要对象：从中分离和提取的新颖工业酶和其他生物活性物质在基因工程、蛋白质工程、发酵工程及矿产资源的开发利用上均有很大的应用价值；更为重要的是，生存在这种环境下的生物在生物系统进化中具有特殊地位，蕴涵着生命进化历程的丰富信息，因而对其环境适应性机理等生理特征的研究，将对研究生命的起源，进而揭示生命现象的本质具有重要的意义。本研究以从厦门周边地区近海温泉和三大洋深海热液区采集得到沉积物和水样，在不同的环境和培养基条件下以高温为主线进行培养并分离得到200多株细菌。其中分离得到产高温蛋白酶、琼脂酶、絮凝剂的菌，还有代谢产物能抑制肿瘤细胞的生长的细菌，有能产生小分子调节剂作用于神经肽受体的细菌。这些菌都有很大的开发利用价值。在鉴定过程中我们在传统微生物鉴定的基础上，采取了细菌全蛋白SDS-PAGE电泳比较分析、RAPD比较分析和16S-23S rDNA间隔区比较分析等分子生物学方法从使鉴定过程简化，结果更可靠。在此基础上，于厦门近海温泉沉积物样品中发现一株兼性厌氧，中度嗜热、嗜盐的新菌株HS1^T。该菌株为革兰氏阴性，温度适应范围为37-56℃，最适生长温度为50-54℃，最高耐受盐度为8 g／L。该菌能还原硝酸盐释放N₂，还原硫酸盐和亚硫酸盐产生H₂S。C15∶0（21.27％），C15∶1 ISO（21.11％）和C15∶1 ANTEISO（16.03％）为该菌三个主要的脂肪酸。16S rDNA序列显示该株菌属于Bacteroides门。长1488-bp的16S rDNA与其同源性最高的Anaerophaga thermohalophila Fru22同源性仅有91.829％，结合其他表型特征、生理生化特征、G-C含量等多方面的因素，我们将HS1^T（DSM 19012^T，CGMCCC 1.5071^T）定义为一个新属thermohalophaga，Thermohalophaga xiamenensis为其模式种。同时利用系统发育学分析方法和多种分子生物学技术，对三大洋深海热液系统多个站点的微生物多样性进行了调查和比较。通过提取各站点沉积物样品的总DNA，通过构建沉积物中的细菌16S rDNA克隆文库，PCR-RFLP分析和DGGE条带序列测定，对沉积物中的微生物类群及其与环境的关系进行了分析。结果表明，各站点得到的序列与已知菌株序列的同源性大都很低，这也表明深海热液环境中还有很多未被培养研究的新种属的细菌。各站点样品中大部分菌的特点都是跟热液环境紧密联系的：跟共生有关的细菌、跟C、S、N代谢相关细菌、高温厌氧菌、铁代谢相关细菌等等。说明采样点具有典型的深海热液生态系统的特点，甲烷代谢和硫代谢在该区域的深海物质能量循环中占据着重要地位。变形菌（Proteobacteria）在各个站点中的分布都很广泛，根据前人调查的结果该菌群正是海洋细菌中分布最广的。另外大量新的极端微生物的存在，预示着这些区域的微生物资源蕴含非常大的开发潜力。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1 前言  12-28
  1.1 海洋微生物的研究概况  12-17
    1.1.1 海洋微生物的分布  13-16
    1.1.2 海洋微生物资源的开发现状及前景  16-17
  1.2 原核生物的鉴定与分类  17-22
    1.2.1 DNA碱基比例(GC含量)  18-19
    1.2.2 DNA-DNA分子杂交  19
    1.2.3 rRNA序列分析  19-21
    1.2.4 基因组DNA多态性  21-22
  1.3 分子生物学技术在微生物生态学上的应用  22-26
  1.4 本论文研究的思路、意义及内容  26-28
2 材料与方法  28-51
  2.1 材料  28-36
  2.2 基本方法  36-40
  2.3 深海、近海温泉微生物的培养  40-43
  2.4 细菌新属的分类鉴定及特性研究  43-47
  2.5 三大洋深海沉积物微生物多态性调查  47-51
3 结果与讨论  51-82
  3.1 深海、近海温泉微生物的分离培养  51-57
    3.1.1 嗜热菌的培养分离与观察  51
    3.1.2 嗜热菌的筛选  51-52
    3.1.3 嗜热菌的鉴定与系统发育分析  52-54
    3.1.4 讨论  54-57
  3.2 一株中度嗜盐、嗜热、兼性厌氧的细菌新属、新种Thermohalophaga Xiamenensis的描述  57-67
    3.2.1 菌株的分离  57
    3.2.2 表型分析  57-63
    3.2.3 脂肪酸成份分析  63
    3.2.4 16S rDNA序列比较  63
    3.2.5 G-C含量分析  63
    3.2.6 RuBisCo基因序列比较  63-64
    3.2.7 讨论  64-65
    3.2.8 嗜热嗜盐菌新属、新种描述  65-67
  3.3 三大洋深海热液区沉积物的微生物种群分布情况  67-82
    3.3.1 深海沉积物样品DNA的提取  67
    3.3.2 深海沉积物样品古菌和细菌16S rDNA基因扩增  67-68
    3.3.3 微生物16S rDNA基因文库的构建及RFLP分析  68-70
    3.3.4 DGGE片段的PCR扩增和DGGE凝胶电泳  70-71
    3.3.5 三大洋的5站点样品中微生物多态性分析和比较  71-81
    3.3.6 讨论  81-82
小结与展望  82-83
参考文献  83-93
附录  93-94
致谢语  94

嗜盐嗜热菌新属新种的分离鉴定和三大洋热液区沉积物微生物种群分析

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