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5株斜带石斑鱼肠道原籍菌的益生作用研究

作　者: 马如龙
导　师: 朱伟云；孙云章
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 斜带石斑鱼益生菌生长消化酶活性免疫功能胃肠道菌群 PCR-DGGE
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以分离自健康斜带石斑鱼肠道的细菌为研究对象,通过对石斑鱼潜在致病菌的抑制作用、对胃肠道环境的耐受能力及生长特性,获得具有益生菌应用前景的5株细菌；并以斜带石斑鱼为试验动物,研究了这5株菌对其生长、消化酶活性、免疫功能和胃肠道菌群的影响。试验分成以下四个部分：一5株益生茵的生物学特性研究体外研究了5株菌DE5 (Bacillus clausii), SE5(Bacillus pumilus)、SE6 (Psychrobacter sp.)、MM1 (Lactococcus lactis)和MM4(Enterococcus faecium)对石斑鱼潜在致病菌的抑制作用和对胃肠道环境的耐受能力,并研究5株菌的生长特性。结果表明,5株菌对4株指示菌(副溶血弧菌、哈维氏弧菌、梅氏弧菌和金黄色葡萄球菌)有选择性地抑制作用。其中SE6、MM1和MM4对4株指示菌均有较强的抑制作用；DE5能够选择性地抑制哈维氏弧菌、梅氏弧菌和金黄色葡萄球菌的生长,SE5能够选择性地抑制副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的生长。生长特性试验结果显示,5株菌的生长速度有一定差异,其中SE5生长速度最快,4 h就进入对数生长期；而其它4株菌相对较慢,8-12 h进入对数生长期。胃肠道环境耐受结果显示,5株菌对不同pH值的人工胃液和不同胆盐浓度的人工肠液均有一定的耐受能力,其中DE5对人工胃液的耐受能力最强,而SE6、SE5、MM4和MM1则次之；SE6对人工肠液的耐受能力最强,而SE5、DE5、MM4和MM1则次之。以上结果提示：这5株菌对石斑鱼潜在致病菌具有一定抑制效果,且生长速度较快,对胃肠道环境有一定耐受能力,具有作为益生菌应用的潜力。二饲料中添加益生菌对石斑鱼生长及部分消化酶活性的影响选择体重40 g左右健康的斜带石斑鱼252尾,随机分成6组,对照组T0和实验组T1、T2、T3、T4和T5,研究添加益生菌对生长性能和消化酶活的影响。T0为不添加益生菌的基础饲料,T1、T2、T3、T4和T5组分别在基础日粮中添加DE5、SE5、SE6、MM1和MM45株细菌(添加量为1×108个/g)。生长试验结果显示：前期(0-30 d),各实验组与对照组(T0)相比,末均重、平均增重、增长率、特定生长率、饲料系数和存活率均无显著性差异；但与TO相比,T3和T4组的末均重、平均增重、增重率和特定生长率均有提高,饵料系数也均有降低；后期(31-60 d),各实验组与对照组(T0)相比,末均重没有显著性差异；T2组平均增重显著高于T0,其它实验组与TO相比差异均不显著；增重率和特定生长率T2和T5显著高于T0,其它实验组与T0相比差异不显著；饵料系数T1、T2、T3和T5显著低于T0,T4与T0相比差异不显著；各实验组与TO相比存活率差异均不显著。全期(0-60 d)的结果显示：各实验组与TO相比,平均增重、增重率和特定生长率均没有显著性差异,而T2组均有提高,除T5组外均显著降低了饵料系数。酶活试验结果显示,添加5株菌对石斑鱼肝胰脏和肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶有不同程度的影响。肝胰脏酶活：与T0相比,T1组显著提高了30 d肝胰脏胰蛋白酶和淀粉酶的活力,脂肪酶的活力也有明显提高,但差异不显著；对60 d肝胰脏胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性没有显著影响；T2组对30 d和60 d肝胰脏胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均没有显著的影响,但30 d和60 d肝胰脏胰蛋白酶、淀粉酶均有明显提高,而对脂肪酶活力影响不大；T3、T4组对30 d和60 d肝胰脏胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均没有显著的影响；T5显著提高了60 d肝胰脏胰蛋白酶活力,对3 O d肝胰脏胰蛋白酶、30 d和60 d肝胰脏淀粉酶和脂肪酶活力没有显著的影响。肠道酶活：与对照组(T0)相比,T1、T2、T3、T4和T5对30 d和60 d肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均没有显著的影响。三饲料中添加益生菌对石斑鱼免疫功能的影响试验设计同第二章,研究添加益生菌对斜带石斑鱼免疫功能的影响。结果显示,与对照组(T0)相比,添加芽孢杆菌DE5 (T1组)30 d血清溶菌酶活力提高了42.85%,显著提高了60 d血清溶菌酶的活力；对30 d血清T-SOD活力没有影响,而60dT-SOD活力提高了11.43%；30 d和60 d IgM含量差异均不显著；但30 d提高了38.89%,60d略低于对照组；补体C3水平在30 d和60d分别提高了11.99%和15.9%；补体C4水平在30 d提高了6.37%,而对60 d补体C4水平影响不大；60 d白细胞吞噬百分率和吞噬指数显著高于T0。添加芽孢杆菌SE5 (T2组)对30 d血清溶菌酶活力没有影响,60 d提高了4.49%；与T0相比,30 d T-SOD活力变化不大,60 d提高了18.49%；30 d IgM含量提高了50%,而60 d IgM变化不大；30 d补体C3水平提高了11.17%,而60 d变化不大；30 d补体C4水平提高了11.43%,而60 d变化不大；60 d白细胞吞噬百分率提高了39.03%,吞噬指数也有提高,但与TO相比差异均不显著。添加嗜冷杆菌SE6(T3组)对30 d和60 d血清溶菌酶活力均没有促进作用；对30 d T-SOD活力没有影响,60 d T-SOD活力提高了6.92%；30 d和60 d IgM含量分别提高了61.11%和12.12%；补体C3水平分别提高15.31%和33.58%；对30 d补体C4水平没有影响,而60 d补体C4水平提高了13.77%；60 d白细胞吞噬百分率和吞噬指数均有提高。添加乳酸菌MM1和MM4对石斑鱼免疫功能也有一定的影响。与TO相比,添加乳酸菌MM1(T4)30 d和60 d血清溶菌酶分别提高了59.18%和25.84%；T-SOD活力分别提高了19.77%和6.92%；IgM含量分别提高77.78%和33.33%；补体C3水平分别提高11.72%和33.58%；补体C4水平分别提高了41.54%和3.85%；对60 d白细胞吞噬活性没有影响。添加乳酸菌MM4(T5)对30 d和60 d血清溶菌酶活力均没有促进作用；对30 d T-SOD活力没有影响,60 d提高了2.79%；30 d和60 d IgM含量分别提高了61.11%和24.24%；补体C3水平分别提高了2.54%和37.56%；对30 d补体C4水平影响不大,而60 d提高了14.57%；60 d白细胞吞噬百分率提高了11.22%；吞噬指数也有提高。总之,添加5株益生菌对石斑鱼免疫功能有一定的促进作用。四饲料中添加益生菌对石斑鱼胃肠道菌群的影响运用PCR-DGGE技术,研究了斜带石斑鱼胃和肠壁茵群的组成,以及添加5株益生菌对石斑鱼胃和肠壁菌群的影响。试验结果显示,石斑鱼胃和肠壁细菌16S rDNA V3基因片段产物经DGGE技术分离,共得到14条共有条带。相似性分析结果表明,石斑鱼胃和肠壁菌群具有较高的相似性,不同个体之间存在一定的差异。对胃和肠壁共有条带(14条)进行切胶测序,结果显示,斜带石斑鱼胃和肠壁的优势菌为Pseudomonas、Uncultured gamma proteobacterium、Bacillus、Nitratireductor、Dietzia、Methylobacterium、Microbacterium和一些不可培养细菌。试验结果还显示,添加5株益生菌对石斑鱼胃和肠壁优势菌群组成有不同程度的影响。与对照组(T0)相比,添加芽孢杆菌DE5(T1组)组胃中葡萄球菌消失,而放线菌属细菌的定植增加,出现了发光菌属细菌；前肠中出现了发光菌属细菌和芽孢杆菌的定植；前肠和后肠中出现了肠球菌属细菌和弧菌的定植。添加芽胞杆菌SE5(T2组),胃中出现了葡萄球菌属细菌和不可培养细菌的定植,不可培养芽孢杆菌属细菌等在胃中的定植增加,而不可培养芽孢杆菌属细菌在前肠和后肠中的定植也增加了。添加嗜冷杆菌SE6(T3组),胃中出现了滕黄微球菌、α-变形菌和β-变形菌的定植；前肠和后肠中芽孢杆菌的定植降低,出现了不可培养α-变形菌和Alcanivorax dieselolei的定植。添加乳酸菌MM1(T4组),葡萄球菌和芽孢杆菌在胃中消失,而出现了不可培养鞘氨醇杆菌属细菌、腐败交替单胞菌、弧菌、不可培养丛毛单胞菌属等的定植；前肠中出现了黄杆菌、不可培养细菌和发光杆菌的定植,后肠中弧菌和黄杆菌的定植增加,胃、前肠和后肠中不可培养细菌(条带15)的定植均有降低。添加乳酸菌MM4(T5组),胃中出现了不可培养α-变形菌的定植,丛毛单胞菌属细菌在胃中的定植增加；前肠和后肠中出现了迪茨氏菌属细菌的定植；后肠中丛毛单胞菌属细菌和不可培养细菌的定植增加。

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摘要 6-9ABSTRACT 9-13中英文对照 13-14引言 14-16文献综述 16-44 1.1 鱼类消化道微生态 16-24 1.2 益生素概况 24-32 1.3 益生菌在水产养殖中的应用前景及存在的一些问题 32-34 1.4 课题的立题依据、目的及意义 34-35 参考文献 35-44第一章 5株益生菌的生物学特性研究 44-58 1.1 材料与方法 44-46 1.2 试验结果 46-50 1.3 讨论 50-54 参考文献 54-58第二章饲料中添加益生菌对石斑鱼生长及部分消化酶活性的影响 58-74 2.1 材料与方法 58-62 2.2 试验结果 62-68 2.3 讨论 68-71 参考文献 71-74第三章饲料中添加益生菌对石斑鱼免疫功能的影响 74-88 3.1 材料与方法 74-77 3.2 试验结果 77-80 3.3 讨论 80-84 参考文献 84-88第四章饲料中添加益生菌对石斑鱼胃肠道菌群的影响 88-110 4.1 材料与方法 88-91 4.2 试验结果 91-103 4.3 讨论 103-107 参考文献 107-110全文结论 110-112致谢 112-114在读学位期间发表的论文 114

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