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转人类胰岛素基因鸡的研究

作　者: 索剑飞
导　师: 雷雪芹
学　校: 河南科技大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 人类胰岛素克隆真核表达载体转基因鸡
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

糖尿病是由于体内胰岛素相对或绝对不足造成的一种常见的内分泌代谢疾病。目前糖尿病已经成为继心脑血管和肿瘤之后第三位严重危害人类健康的疾病。随着人类社会的发展,营养性肥胖、缺乏运动、老龄化等问题越来越严重,这将大大提高糖尿病的发病率。仅我国糖尿病患者的人数就高达3000多万,且每年仍以20%的速度递增。而胰岛素是机体降低血糖的唯一的一种激素,也是临床上治疗人类I型糖尿病的首选药物,因此医用胰岛素的市场需求量也随之加大。而胰岛素的生产方法从最初直接从人和动物胰腺中提取,发展到利用不同生物类型的基因工程生产胰岛素。鸡蛋作为生物反应器因其生产周期短、成本低、蛋白质易于分离和纯化等独特的优势,成为今后生产药用蛋白的研究方向。本实验首先是从人类胎儿胰腺中提取胰腺细胞总RNA,并依据Genbank上公布的人类胰岛素基因序列,利用primer5.0生物学软件设计出一对特异性引物,采用RT-PCR法获得了350bp的人类胰岛素基因片段(INS),测序结果表明克隆的人类胰岛素基因序列和Genbank公布的一致。然后构建出pUC57-INS,用于人类胰岛素基因的保存和扩增。最后再将INS片段亚克隆到含有绿色荧光蛋白标记基因的真核表达载体pEGFP-N1上,后经PCR、酶切和测序等方法证明人类胰岛素基因真核表达载体pEGFP-N1-INS构建成功,用于制备转人类胰岛素基因鸡方面的研究。本试验采用了脂质体包埋和鸡胚显微注射的方法将构建好的pEGFP-N1-INS转染至鸡胚中来制备转基因鸡。先后收集河南卢氏绿壳蛋鸡种蛋220枚,设置未处理的20枚种蛋为空白对照组孵化后,发现种蛋受精率为85%。转基因操作后的200枚种蛋在孵化过程中共获得不同胚龄的死胚82只,雏鸡24只,操作后未发育的转基因种蛋94枚。先后对82只死胚进行融合蛋白(人类胰岛素与绿色荧光蛋白)的绿色荧光检测,发现4只死胚组织有绿色荧光出现,蛋白阳性率为4.88%。然后再利用primer5.0生物学软件设计的一对特异性引物,对荧光检测呈阳性的死胚组织进行PCR检测,有2只呈阳性,人类胰岛素基因检出率为2.44%。目前还3只活鸡,为保护试验材料,仅作血液目的蛋白检测,结果未发现蛋白阳性个体。本试验说明依次方法制备转人类胰岛素基因鸡是可行的。为利用转基因鸡高效生产药用胰岛素等对人类有益的生物制品奠定了基础。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-9
第1章综述  9-20
  1.1 人类胰岛素简述  9-11
    1.1.1 人类胰岛素的化学结构  9
    1.1.2 人类胰岛素的生物学作用  9-10
    1.1.3 人类胰岛素缺乏症及治疗  10-11
  1.2 医用胰岛素的生产方法  11-15
    1.2.1 从动物的胰腺中直接提取  11-12
    1.2.2 人工合成或者转化的方法来制备  12
    1.2.3 通过基因工程的方法来制备  12-15
  1.3 家禽转基因技术的分类  15-18
    1.3.1 直接体内法  15-17
    1.3.2 间接体内法  17-18
  1.4 本课题的研究方法  18
  1.5 本研究的目的和意义  18-19
  1.6 本课题的技术路线  19-20
第2章人类胰岛素基因的克隆  20-27
  2.1 材料和仪器  20
  2.2 试剂及配制  20
  2.3 实验方法  20-25
    2.3.1 获取并保存人类胰腺  20-21
    2.3.2 提取人类胰腺细胞总RNA  21
    2.3.3 甲醛凝胶电泳鉴定人类胰腺总RNA  21-22
    2.3.4 设计引物  22
    2.3.5 RT-PCR 法制备INS 基因  22-23
    2.3.6 INS 基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定  23
    2.3.7 PCR 法大量制备INS 基因  23-24
    2.3.8 INS 基因的回收  24-25
    2.3.9 INS 基因的进一步纯化  25
  2.4 结果与讨论  25-27
第3章重组扩增质粒pUC57-INS 的构建  27-35
  3.1 材料和仪器  27
  3.2 试剂及配制  27
  3.3 实验方法  27-33
    3.3.1 感受态细胞的制备  27-28
    3.3.2 T-载体pUC57 的连接  28
    3.3.3 pUC57-INS 转染大肠杆菌DH5α  28-29
    3.3.4 含有pUC57-INS 阳性克隆菌的筛选  29
    3.3.5 阳性克隆菌的扩大培养及质粒的提取  29-30
    3.3.6 pUC57-INS 的琼脂糖凝胶电泳鉴定  30-31
    3.3.7 pUC57-INS 的回收  31
    3.3.8 pUC57-INS 的PCR 鉴定  31-32
    3.3.9 pUC57-INS 的双酶切鉴定  32
    3.3.10 pUC57-INS 的测序鉴定  32-33
  3.4 结果与讨论  33-35
第4章重组表达质粒pEGFP-N1-INS 的构建  35-44
  4.1 材料和仪器  35
  4.2 试剂及配制  35
  4.3 实验方法  35-41
    4.3.1 表达质粒pEGFP-N1 的双酶切  35-36
    4.3.2 pEGFP-N1 的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳  36
    4.3.3 线性片段pEGFP-N1 的回收  36-37
    4.3.4 pUC57―INS 的双酶切  37
    4.3.5 pUC57-INS 酶切产物琼脂糖凝胶电泳  37
    4.3.6 目的基因片段INS 的回收  37
    4.3.7 线性表达载体pEGFP-N1 与目的基因片段INS 的连接  37-38
    4.3.8 重组表达质粒pEGFP-N1―INS 的琼脂糖凝胶电泳鉴定  38
    4.3.9 pEGFP-N1-INS 的回收  38
    4.3.10 pEGFP-N1―INS 的PCR 鉴定  38
    4.3.11 pEGFP-N1-INS 的双酶切后电泳鉴定  38
    4.3.12 pEGFP-N1-INS 的测序  38-39
    4.3.13 pEGFP-N1-INS 转染于大肠杆菌DH5ａ  39
    4.3.14 含有pEGFP-N1―INS 阳性克隆菌DH5ａ的筛选  39-40
    4.3.15 阳性菌的扩大培养及质粒提取  40-41
    4.3.16 重组表达质粒pEGFP-N1―INS 的琼脂糖凝胶电泳鉴定  41
    4.3.17 pEGFP-N1-INS 的回收和纯化  41
  4.4 结果与讨论  41-44
第5章鸡胚细胞的转染  44-50
  5.1 材料和仪器  44
  5.2 试剂及配制  44
  5.3 实验方法  44-45
    5.3.1 转基因操作  44
    5.3.2 鸡胚的孵化  44-45
    5.3.4 对死胚和死亡雏鸡进行检测  45
  5.4 结果与讨论  45-50
    5.4.1 孵化及岀雏情况  45-47
    5.4.2 鸡胚组织荧光蛋白检测情况  47-48
    5.4.3 荧光蛋阳性的鸡胚组织PCR 检测情况  48
    5.4.4 存活雏鸡血液检测情况  48-49
    5.4.5 对制备转基因鸡研究的展望  49-50
第6章结论  50-51
参考文献  51-55
缩略语词汇表  55-56
致谢  56-57
攻读硕士学位期间发表的与学位论文相关的学术论文及专著  57

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