学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

脂联素在L-02细胞中对肝糖代谢信号转导机制的研究

作　者: 杜春红
导　师: 刘德敏
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人脂联素糖尿病真核表达人肝细胞株脂质体重组蛋白环腺苷酸诱导因子结合蛋白辅激活物2(TORC2) 环腺苷酸诱导因子结合蛋白(CREB) 葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 32次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的：在人肝细胞株L-02中获取具有生物学活性的脂联素重组蛋白的分泌性表达,并在L-02细胞中探讨脂联素抑制糖异生的信号转导机制。方法：①从人脂肪组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法得到人脂联素基因cDNA序列,自行设计引物一对,经PCR扩增人脂联素基因完全编码序列,构建pMD18-T/ADPN重组克隆质粒,目的序列测序鉴定；PCR扩增脂联素目的片段,连至真核表达载体pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO,构建脂联素真核表达质粒pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN。②将pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN转化入TOP10感受态细胞,筛选可能含有阳性克隆的白色菌落进行鉴定,提取阳性克隆中的重组质粒,命名为pCDNA3.1-ADPN。③将pCDNA3.1—ADPN经脂质体介导、G418筛选后转染至人肝细胞株L-02,免疫荧光法观察转染率,收获的细胞裂解液及细胞培养上清经SDS-PAGE、western blot、细胞免疫组织化学法检测脂联素表达情况。④用含0 mmol/L、5 mmol/L、15 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖的培基分别模拟无糖、低糖、中糖、高糖环境。将转染pCDNA3.1—ADPN的L-02细胞和对照组分别在上述环境中处理24 h,酶学法测定培养基血糖,观察重组脂联素蛋白的活性。⑤以western blot测定正常L-02组、转染组、30 mmol/L glucose处理组和“饥饿”组(72 h未换液)中phospho-AMPK、及其下游环腺苷酸反应元件结合蛋白(CREB)、phospho-CREB蛋白表达情况,免疫组化法观察四组细胞中环腺苷酸反应元件结合蛋白辅激活物2(TORC2)的定位情况,葡萄糖脱氢酶偶联法测定葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)活性。结果：①成功构建脂联素克隆质粒pMD18-T/ADPN和真核表达质粒pCDNA3.1/CT-GFP-TOPO-ADPN(简称pCDNA3.1-ADPN)。②转染pCDNA3.1-ADPN的L-02细胞在免疫荧光显微镜下可见绿色荧光,表明转染成功,转染率在60%以上。③在细胞培养上清和沉淀中均检测到表达产物,表明重组蛋白利用自身信号肽获得分泌性表达。细胞裂解液和细胞培养上清中表达的重组蛋白分子量约为57 kD,具有人脂联素抗原性。④转染pCDNA3.1—ADPN的L-02细胞高糖(30mmol/L)处理24 h后其培基血糖低于对照组(p<0.05),但在无糖、低糖和中糖环境中无明显差异(p>0.05)。⑤与其它组比较,转染组：phospho-AMPK蛋白表达升高(p<0.05), TORC2主要在定位在细胞质中,G6P酶的活性显著降低(p<0.05),但CREB、phospho-CREB蛋白表达无明显差异(p>0.05)。结论：我们成功构建了人脂联素真核表达质粒,并在人肝细胞株L-02中得到可溶性、分泌性表达,获得的重组蛋白具有生物学活性。脂联素抑制糖异生的机制可能与活化phospho-AMPK,抑制TORC2进入核内,从而抑制糖异生酶G6P的表达有关,其信号转导通路可能为Adiponectin-AMPK-CREB-TORC2-糖异生关键酶。这为进一步研究脂联素的信号通路,并探寻新的信号分子奠定了坚实的基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-9
符号说明  9-11
前言  11-14
  研究现状、成果  11-12
  研究目的、方法  12-14
总体技术路线  14-17
一、脂联素真核表达质粒的构建及在L-02细胞中表达  17-48
  1.1 材料和方法  17-31
  1.2 结果  31-38
  1.3 讨论  38-46
  1.4 小结  46-48
二、脂联素调节肝糖异生信号转导机制的研究  48-62
  1.1 材料和方法  48-51
  1.2 结果  51-55
  1.3 讨论  55-61
  1.4 小结  61-62
结论  62-63
参考文献  63-70
发表论文和参加科研情况说明  70-71
附录  71-74
综述  74-80
  综述参考文献  78-80
致谢  80

脂联素在L-02细胞中对肝糖代谢信号转导机制的研究

内容摘要

全文目录

相似论文