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不同真核载体表达人神经生长因子

作　者: 戚菁
导　师: 李越希
学　校: 南京医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人神经生长因子基因克隆真核表达生物活性
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

神经生长因子(NGF)是最早发现的神经营养因子,对神经系统和非神经系统均有影响,被广泛的用于治疗各种神经损伤性疾病。本研究通过构建人神经生长因子的几种不同真核表达载体,并增加一些转录及翻译调控元件、更换信号肽序列,比较人神经生长因子的表达水平,从中选择适合高表达人NGF的真核载体,为大规模生产NGF奠定基础。构建三种重组质粒,分别是pMD902-β-NGF、pcDNA3.1-His-β-NGF和pcDNA3.1-4.0-His-β-NGF。重组质粒pMD902-β-NGF:将pcDNA3.1 -β-NGF中β-NGF基因插入pMD902载体的Sal I酶切位点间。重组质粒pcDNA3.1-His-β-NGF:以pcDNA3.1-β-NGF为模板,通过设计引物进行PCR扩增,在β-NGF基因前插入一段转录调控区序列,8×His标签和EK(肠激酶)位点,将NGF的信号肽基因序列替换为人IgG kappa链的信号肽基因序列。即最终是将神经生长因子基因及调控序列(转录调控区-优化的信号肽-8×His-EK(肠激酶)-NGF)插入载体pcDNA3.1的BamH I和XhoⅠ位点中。重组质粒pcDNA3.1-4.0-His-β-NGF:化学合成载体pcDNA4.0上的一段翻译调控序列,插入到载体pcDNA3.1的HindⅢ和BamH I位点中,构建新载体pcDNA3.1-4.0,再将重组质粒pcDNA3.1-His-β-NGF中的神经生长因子基因及调控序列(转录调控区-优化的信号肽-8×His-EK(肠激酶)-NGF)插入新载体pcDNA3.1-4.0的BamH I和XhoⅠ位点中。将上述三个重组质粒及质粒pcDNA3.1-β-NGF转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),进行筛选表达。一个月后,ELISA检测转染重组质粒的细胞上清。检测结果表明:四个重组质粒均能表达NGF蛋白。pMD902-β-NGF的表达量约为0.6ng/ml,pcDNA3.1-β-NGF约为4.7ng/ml,pcDNA3.1-His-β-NGF约为17.7ng/ml,pcDNA3.1-4.0-His-β-NGF约为28.3 ng/ml。鸡胚背根神经节检测法检测四个重组质粒表达NGF蛋白的生物学活性,它们均能刺激鸡胚背根神经节周围长出放射状的神经纤维,表明表达的人神经生长因子有较好的生物学活性。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-11
第一部分重组人神经生长因子质粒的构建  11-31
  材料  11-12
  第一节重组质粒pMD902-β-NGF 的构建  12-20
    方法  12-17
    结果  17-19
    分析与讨论  19-20
  第二节重组质粒pcDNA3.1-His-β-NGF 的构建  20-26
    方法  20-23
    结果  23-25
    分析与讨论  25-26
  第三节重组质粒pcDNA3.1-4.0-His-β-NGF 的构建  26-31
    方法  26-28
    结果  28-30
    分析与讨论  30-31
第二部分：重组人神经生长因子的表达及活性测定  31-39
  第一节重组人神经生长因子的表达  31-37
    方法  31-33
    结果  33-36
    分析与讨论  36-37
  第二节测定重组人神经生长因子的生物活性  37-39
    方法  37
    结果  37-38
    分析与讨论  38-39
小结  39-40
参考文献  40-43
附录一  43-45
附录二  45-46
综述及参考文献  46-55
  参考文献  52-55
致谢  55

不同真核载体表达人神经生长因子

内容摘要

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