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柴胡及同属混淆品种子的系统鉴别研究

作　者: 文雪花
导　师: 聂凤禔
学　校: 河北医科大学
专　业: 药物分析学
关键词: 柴胡种子显微特征扫描电镜超微特征薄层色谱法紫外分光光度法染色体 PAGE RAPD DNA
分类号: R282.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

柴胡始载于《神农本草经》,为常用中药。中国药典2005年版收载北柴胡Bupleurum chinese DC.和红柴胡(狭叶柴胡)B.scorzonerifolium Willd.两种。但据文献记载和实地调查,柴胡属植物的绝大多数种类在产地均作药用柴胡,并且在生长地常常有数种柴胡混杂生长。由于药用柴胡使用品种混乱,化学成分复杂,有效成分含量相差悬殊,造成柴胡及其制品质量的不稳定。柴胡为河北省道地药材,主要分布有北柴胡、烟台柴胡、百花山柴胡、兴安柴胡、红柴胡、黑柴胡等,另外,三岛柴胡在我省大面积种植栽培。本实验利用传统的鉴别方法如性状、显微、理化鉴别并采用细胞生物学、分子生物学等现代分析技术对柴胡属种子进行综合的鉴别研究。从而为鉴别柴胡属种子的物种提供科学依据;同时对柴胡GAP生产的实施,保证种质资源的稳定性、可控性具有指导意义,为规模化、规范化种植提供可靠的依据。本实验方法快速、简便、实用,能满足基层需要,为柴胡种子的品种鉴定、开发和应用奠定了科学基础。第一部分性状、显微、理化鉴别目的:应用快速、简便、实用的方法,建立柴胡种子的外观性状、显微特征、理化性质方面的综合鉴别信息指征。方法:1外观性状观察。2脱色表面片制备:(1)脱色:拨取种皮切成1~2 mm小块浸入水合氯醛(1:1)水溶液中。(2)压片观察。3石蜡横切片制备:(1)取材和固定:种子用蒸馏水4℃浸泡一周以上,F.A.A固定液固定两周以上。(2)脱水:依次用浓度为70 %、80 %、90 %、95 %的乙醇溶液、无水乙醇进行脱水,每隔2~3 h调换溶液。(3)透明:二甲苯:无水乙醇(1:1)浸种1 h后,转入二甲苯中至种子透明为止。(4)浸蜡:65℃恒温箱中进行,半小时调蜡一次,至种子完全浸透。(5)包埋和切片:石蜡包埋,切片厚度12μm。(6)贴片和熔蜡。(7)染色:番红-固绿双重染色。(8)脱水与封藏。4种皮扫描电镜观察:(1)清洗:取种子用50 %乙醇超声清洗5 min。(2)脱水:50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %乙醇逐级脱水,每一级脱水两次,每次30 min,其间不断震荡清洗。(3)固定:戊二醛固定30 min。(4)电镜观察:真空喷金后,进行观察。5紫外扫描图谱特征:(1)取适量柴胡种子粉末,用不同极性的试剂,依次为石油醚、乙酸乙酯、无水甲醇,索氏提取3 h,分别制备供试液A、B、C。(2)扫描波长为200~400 nm的紫外吸收图谱。(3)图谱分析。6薄层色谱鉴别:(1)分别将供试液A、B浓缩,供点样;(2)点样,展开。(3)显色、观察、照相。结果:1宏观性状:几种柴胡种子均为双悬果,短圆柱形,具两个分果,其分果呈长椭圆形,顶端残留黄棕色突起的柱基,基部有的有细小的分果柄,每个分果有5条纵棱,整体性状相似不易区分。2脱色表面片:几种种子在种皮细胞形状、细胞壁增厚情况、气孔类型和油管等方面无明显的区别。3石蜡横切片:几种种子在种皮细胞层数和油管的数目、直径大小等特征上都有明显差别。4扫描电镜观察:几种种子的超微特征有一定的差别。5紫外扫描图谱:利用不同极性试剂分别对几种柴胡种子提取,可以定性或定量的鉴别柴胡种子。其中石油醚提取部分的吸收峰数目和位置有一定的差别。6薄层色谱:几种柴胡种子提取液的薄层图谱有一定差别,可用于鉴别。结论:柴胡属不同种植物的种子在外观性状、显微特征、理化性质存在差异,由此可以用于鉴别。方法快速、简便、实用,适用于几种柴胡种子的快速鉴别。第二部分细胞生物学及分子生物学特征研究目的:利用染色体组型分析、种子蛋白质PAGE、SDS-PAGE技术及RAPD技术研究几种柴胡种间的综合鉴别信息指征,从细胞水平及分子水平鉴别真伪,并为柴胡种子的品种筛选提供依据。方法:1根尖体细胞染色体标本片制备:(1)预处理:挑选饱满的种子,于25℃下萌发,待根尖长到1.0~2.0 cm时,切取约2 mm的根尖于蒸馏水中4℃低温处理24 h(。2)固定:卡诺固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)固定1.0~1.5 h。(3)解离:95 %乙醇:浓盐酸解(1:1)离8~15 min。(4)后低渗:重蒸水低渗,时间10~15 min。(5)染色:改良石炭酸品红液染色。(6)封片:冰冻后揭去盖片,中性树胶封片。(7)显微照相、计数、测量。2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征研究:(1)制备供试品溶液。(2)制备分离胶和浓缩胶。(3)电泳:恒定电压120~180 V。(4)染色和洗脱:考马斯亮蓝(R-250)染色,脱色液洗脱至背景清晰为止。(5)结果分析:绘图并测定特征谱带的泳动率。3 RAPD技术鉴别:(1)高盐低pH法提取纯化植物总DNA。(2)PCR扩增及引物筛选。(3)图谱分析。结果:1根尖体细胞染色体组型特征:柴胡属植物种子在染色体数目上不尽相同,北柴胡,及其变型烟台柴胡、百花山柴胡的染色体数目均为2n=12,而三岛柴胡的染色体数目为2n=26,兴安柴胡的染色体数目为2n=64,红柴胡染色体数目为2n=12,黑柴胡染色体数目为2n=12;再者,几种柴胡种子的染色体的长度、变异系数有明显区别。2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征:北柴胡,及其变型烟台柴胡和百花山柴胡的谱带数目和位置稍有不同;而北柴胡、三岛柴胡、兴安柴胡、红柴胡、黑柴胡之间有明显区别。3 RAPD鉴别研究:筛选出可对几种柴胡种子进行有效扩增的引物条,对柴胡种子扩增得到的条带在数目和位置上均有明显差异,可用于鉴别。结论:应用生物学技术对柴胡种子进行鉴别研究,可以较根本的揭示柴胡属种间的差异,为柴胡种源筛选提供依据。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-14
研究论文柴胡及同属混淆品种子的系统鉴别研究  14-71
  引言  14-16
  第一部分柴胡及同属混淆品种子的性状、显微、理化鉴别  16-46
    前言  16
    材料与方法  16-21
    结果  21-26
    附图  26-43
    附表  43-44
    讨论  44-45
    结论  45
    参考文献  45-46
  第二部分柴胡及同属混淆品种子的细胞生物学及分子生物学研究  46-71
    前言  46-47
    材料与方法  47-52
    结果  52-54
    附图  54-65
    附表  65-67
    讨论  67-69
    结论  69
    参考文献  69-71
综述中药种子的现代鉴别研究  71-85
致谢  85-86
个人简历  86

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