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阿克拉霉素对米托蒽醌杀伤Hela细胞的影响

作　者: 韩硕
导　师: 阎蕴力
学　校: 河北医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 阿克拉霉素米托蒽醌细胞凋亡拓扑异构酶Ⅱ 单细胞凝胶电泳 DNA链断裂
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

目的 : 本实验用Hela细胞(人宫颈癌细胞株)作为受试对象，探讨拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase, topoⅡ)催化抑制剂阿克拉霉素（Aclarubicin, ACR）对topoⅡ毒性抑制剂米托蒽醌（Mitoxantrone, MIT）作用的影响。方法 : 将Hela细胞在37℃，5%的CO2环境下进行传代培养。待细胞进入对数生长期后，预先加入ACR（0.2 μmol/L）处理20分钟后，再加入不同浓度的MIT（1nM、5 nM、10 nM、50 nM、100 nM）作用1小时。另设相同浓度的MIT单独用药组，以及阴性对照样品。细胞经药物作用后主要用于检测下列实验指标：（1）双荧光分析细胞凋亡率：将细胞用磷酸缓冲液（PBS）制成细胞悬液。用吖啶橙（AO）和嗅乙啶（EB）各为100μg/ml混合染液染色。每组样品随机检测300个细胞，并计数细胞活率、照相记录。采用 t检验分析实验结果。（2）单细胞凝胶电泳：细胞与低熔点琼脂糖凝胶混合制片，加入碱性裂解液作用1小时，电泳30分钟，后经中和、染色、荧光显微镜分析记录。实验数据采用t检验进行统计分析。（3）免疫细胞化学检测topoⅡ表达：细胞爬片，加入药物作用后，经固定、修复抗原、封闭内源性过氧化物酶、以及封闭非特异性抗体。然后依次与一抗，小鼠抗人topoⅡ多克隆抗体、二抗（小鼠IgG）、三抗（链酶卵白素标记的辣根过氧化物酶，HRP）作用、二氨基联苯胺<WP=5>（diaminobenzidine；DAB）显色，显微镜分析、照相。以上各项检测指标均以不加药物组细胞作为实验对照。实验所得数据采用t检验进行统计学处理，所有统计过程均在SPSS 10.0统计软件包中进行。结果 : 采用AO/EB双荧光染色观察不同用药组之间细胞凋亡的差异，可见细胞经不同浓度的MIT单独作用后，于50 nM、100 nM浓度下细胞凋亡明显，20小时后凋亡率>90%，说明凋亡率随药物浓度的增加而增加。ACR预先处理后再加入MIT于10 nM、50 nM、100 nM浓度时的凋亡率与相同浓度MIT单独作用的凋亡率相比较，凋亡率低，二者有显著差别。在单细胞凝胶电泳实验中我们观察到：单独加入0.2μM的ACR作用后未见明显的DNA断裂。MIT（1nM、5 nM、10 nM、50 nM、100 nM）单独用药组，可见细胞DNA断裂的断裂程度随着药物浓度的提高而增加。经预先加入0.2 μmol/L浓度的 ACR 作用20分钟后，再加入MIT作用1小时后与 MIT单独用药样品之间比较，ACR能够抑制MIT造成的DNA链的损伤。进一步采用免疫组织化学方法，检测不同药物组作用后对Hela细胞内topoⅡ的表达情况可见：ACR预先处理组和MIT单独处理组与对照组相比topoⅡ表达增加；经预先加入0.2 μmol/L浓度的 ACR 作用20分钟后，再加入MIT作用1小时的Hela细胞与 MIT单独用药样品之间比较，topoⅡ的表达减少。结论 : （1）topoⅡ活性抑制剂CAR与topoⅡ毒性抑制剂MIT能够诱导细胞凋亡。ACR能够干扰MIT对<WP=6>Hela细胞的抑制作用，使细胞凋亡率下降。（2）ACR可拮抗MIT 对Hela细胞DNA链的损伤，使DNA链断裂减少。（3）ACR可拮抗MIT 对Hela细胞topoⅡ的表达，使 topoⅡ的表达水平降低。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
研究论文阿克拉霉素对米托蒽醌杀伤Hela细胞的影响  11-41
  前言  11-12
  材料与方法  12-17
  结果  17-19
  讨论  19-24
  小结  24
  参考文献  24-30
  附表、附图  30-41
综述 DNA断裂研究方法进展  41-63
致谢  63-64
个人简历  64

阿克拉霉素对米托蒽醌杀伤Hela细胞的影响

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