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胶体金免疫层析法及其在氯霉素快速检测中的初步研究

作　者: 张琪
导　师: 杨祥良
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 免疫层析胶体金氯霉素单克隆抗体试纸条
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

胶体金免疫层析试纸条（Colloidal Gold Immunochromatographic Strips）检测法是利用抗原和抗体的特异性结合反应对微量抗原或抗体进行测定的方法。本文以食品中禁用的抗生素----氯霉素（CAP）为检测对象,主要开展了以下工作:（1）采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金（Colloidal Gold）,根据柠檬酸三钠加入量的不同,考察加热不同时间对胶体金制备的影响,并通过分光光度法、激光粒度仪法,透射电镜法对合成的胶体金进行质量鉴定。并以粒径大小作为考察因素,对分光光度法、激光粒度仪法、透射电镜法进行比较。（2）采用体内诱生腹水法生产了氯霉素单克隆抗体,并通过蛋白G亲和层析柱对单抗进行纯化,然后通过蛋白经验公式OD₂₈₀/1.35对单抗含量进行初步测定,接着通过间接竞争ELISA法对单抗效价进行测定以及活性进行鉴定,最后建立了间接竞争ELISA法测定CAP的标准曲线。（3）采用分光光度法确定胶体金和氯霉素单抗偶联的最适pH值以及单抗的最小加入量,并通过高速离心法对偶联物进行纯化,接着通过分光光度法,激光粒度仪法,透射电镜法对偶联物的粒径大小,分布情况进行表征,最后通过间接竞争ELISA法和试纸条法对偶联物活性进行鉴定。（4）采用EDC法将琥珀氯霉素和BSA进行偶联,通过分光光度法进行偶联率的测定,并通过间接竞争ELISA法对偶联物的活性进行鉴定。（5）对试纸条所用溶液以及试纸条耗材进行筛选和处理,将各部件组装成试纸条,对阴性样品和阳性样品（10ng/mL CAP）进行检测。通过以上研究获得以下结果:（1）柠檬酸三钠加入量1.0mL时,最优加热时间为15min;柠檬酸三钠加入量1.5mL时,最优加热时间为12min;柠檬酸三钠加入量为4.0mL时,最优加热时间为9min。（2）通过体内诱生腹水法共生产氯霉素单抗约6.147mg,根据蛋白含量的高低,把单抗分装成两管,低浓度管单抗效价1:3000,IC₅₀为0.368ppb,检出限为0.047ppb;高浓度单抗效价1:50000,IC₅₀为0.426ppb,检出限为0.055ppb。（3）胶体金和氯霉素单抗偶联的最适pH值为8.0,200uL胶体金对应的最小蛋白含量为1.92ug。偶联物粒径比胶体金大,并具有生物活性。（4）CBSA/CCAP=34.4,即每个BSA分子上连接了34.4个氯霉素分子,偶联物具有活性,包被抗原用于ELISA实验的最佳稀释比为1:13000。（5）试纸条实验结果表明:阴阳性样品在检测线处肉眼可见明显区别,试纸条检测限达10ng/mL。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 绪论  10-21
  1.1 胶体金标记技术  10-17
  1.2 胶体金免疫层析技术  17-18
  1.3 氯霉素的应用及其危害  18-19
  1.4 本论文主要研究内容及意义  19-21
2 胶体金的制备及其表征  21-34
  2.1 实验部分  21-23
  2.2 结果与分析  23-33
  2.3 本章小结  33-34
3 氯霉素单克隆抗体的生产、纯化及鉴定  34-46
  3.1 实验部分  34-40
  3.2 结果与分析  40-45
  3.3 本章小结  45-46
4 胶体金氯霉素单抗偶联物的制备及其鉴定  46-54
  4.1 实验部分  46-49
  4.2 结果与分析  49-53
  4.3 本章小结  53-54
5 胶体金法氯霉素免疫层析试纸条的初步研制  54-66
  5.1 实验部分  54-59
  5.2 结果与分析  59-64
  5.3 本章小结  64-66
6 全文总结  66-68
致谢  68-70
参考文献  70-72

胶体金免疫层析法及其在氯霉素快速检测中的初步研究

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