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NRD1基因的生物信息学分析及其在P19细胞向心肌样细胞分化过程中的表达变化

作　者: 王飞
导　师: 钱玲梅
学　校: 南京医科大学
专　业: 内科学
关键词: 生物信息学 P19细胞心肌样细胞细胞分化苯乙肼裂解酶
分类号: R541
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

【目的】利用生物信息学软件,在线对NRD1基因进行生物信息学分析。体外培养P19细胞,并诱导P19细胞向胚胎心肌样细胞分化。观察苯乙肼裂解酶1(NRD1)在p19细胞向心肌样细胞诱导分化过程中表达的变化。【方法】利用DNA Star及Blast等软件,在线分析NRD1基因的核苷酸基本特征及同源性;蛋白质理化性质采用ProtParam在线工具分析;蛋白质二级结构的预测利用SOPMA在线工具完成;蛋白质导肽及信号肽预测、跨膜区分析、疏水性/亲水性及可溶性分析利用在线工具SignalP 3.0、TMpred、ProtScale、ProtParam等完成;利用SMART工具进行结构域( domain)分析, PSORTⅡ预测亚细胞定位;用Swiss-Pdb Viewer、Gene3D、MMDB软件预测NRD1蛋白的三维结构。P19细胞经复苏、培养、传代后,在体外二甲基亚砜(DMSO)诱导下向心肌细胞分化,在光镜、倒置显微镜下观察细胞形态学变化。p19细胞经1%二甲基亚砜(DMSO)悬浮诱导培养4d,续用生长培养基贴壁培养至16d,观察细胞跳动情况,用Western Blot鉴定细胞肌钙蛋白I(cTnI),并采用RT-PCR、Western Blot检测p19细胞中NRD1基因mRNA和蛋白的表达。使用spss 13.0软件进行数据整理和统计。【结果】NRD1基因mRNA长4155 bp;该基因起始密码子为ATG,终止密码子为TAA, 29～3514 bp为开放阅读框;其阅读框前有同编码框的蛋白翻译终止子TGA,阅读框后有polyA加尾信号aataaa;NRD1基因定位于4号染色体4 C7;NRD1含31个外显子和30个内含子。NRD1编码蛋白为1161个氨基酸,相对分子质量约14281.6,理论等电点4.77,人、小鼠、大鼠及酵母等物种的该基因同源性较高;其常见的结构元件主要有α-螺旋(α-helix)、β-转角(β-turn )、β-折叠片(β-pleated sheet)和无规则卷曲( random coil)等;α-螺旋和无规则卷曲是NRD1最大量结构元件,而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中;分泌途径信号肽( signal pep tide)的分值为0.631,信号肽锚点的分值为0.000,最大可能的酶切位置是19-21bp,但分值为0.353;NRD1整条肽链共有四个可能的跨膜结构域;用ProtScale预测NRD1氨基酸序列的疏水性/亲水性,结果表明多肽链最低分值(-3.500) ,最高分值(2.667) ,亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,且多于疏水性氨基酸;用ProtParam http://us.expasy.org/tools/protparam . html在线工具分析NRD1基因理化性质,同时可以观察到该基因总平均亲水性:-0.514,登陆蛋白可溶性分析在线服务器(http://biotech.ou.edu/),提交氨基酸序列即可得到结果,结果提示NRD1编码的蛋白分子有83.7 %可能性是溶于水的可溶性蛋白;运用SMART工具(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set _mode. cgi?GENOMIC=1)分析的结果表明, NRD1的中间部位有三段肽酶活性序列,存在很多内部紊乱序列;运用PSORTⅡ工具分析(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)其亚细胞定位信息,结果显示, 26.1 %可能存在于胞质, 13.0 %可能存在于胞核, 39.1 %可能定位于线粒体, 4.3 %可能位于细胞骨架等;用Swiss-Pdb Viewer、Gene3D、MMDB软件预测出了NRD1蛋白的三维结构。复苏后未分化的P19细胞大小均匀、分散,胞体小,呈圆形,3～4 h开始有细胞贴壁,呈不规则扁平状,24h后细胞长满瓶底的50%左右,48h细胞生长密集。1%二甲基亚砜(DMSO)诱导4 d,有细胞聚集体形成。诱导4d后,使细胞贴壁生长,以分散、克隆集落方式增殖。d8,可以看见心肌样搏动,随分化时间延长,细胞形态多样化,梭形细胞增多。p19细胞于诱导分化的第8天出现自发性节律跳动, cTnI蛋白呈阳性。NRD1基因在分化的第0～10天表达显著增高,各时间点之间差异有统计学意义(P<0.05);第8～14天该基因表达趋于稳定,各时间点之间差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】小鼠NRD1基因mRNA序列及蛋白序列都可以查到。蛋白偏酸性,原子组成以C、H、O、N为主,含少量S元素;人、大鼠、小鼠及原核生物酵母等有较高同源性,说明该基因是一个对生物体功能比较重要且比较保守的蛋白;NRD1蛋白不具有导肽,该蛋白不是分泌性蛋白,可能不是信号肽;NRD1整条肽链共有四个可能的跨膜结构域;疏水性/亲水性分析结果可认为NRD1是亲水性蛋白,可能是可溶性蛋白;预测出的内部的三段肽酶活性序列可能使其具有肽酶活性,内部紊乱序列可能使其具有折叠特性;亚细胞定位最可能位于线粒体,其次为细胞质,再次为细胞核内;该蛋白存在三级结构,是一个功能蛋白。P19细胞在1% DMSO诱导下已有向心肌细胞分化的趋势,有类似胚胎心肌样细胞形成。NRD1基因在p19细胞向心肌细胞分化过程中表达逐渐上调,可能参与心肌细胞的分化和发育。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
前言  11-13
材料与方法  13-31
  1 生物信息学分析的材料和方法  13-15
  2 细胞培养和诱导材料  15-17
  3 Nardilysin RT-PCR的材料与方法  17-22
  4 Nardilysin Western blot的材料与方法  22-31
结果  31-39
  1 生物信息学分析的结果  31-35
  2 P19细胞的培养和诱导分化的结果  35-36
  3 P19细胞向心肌样细胞分化过程中NRD1基因表达的变化  36-39
讨论  39-42
小结  42-43
参考文献  43-45
中英文对照  45-46
文献综述  46-61
  参考文献  53-61
发表文章复印件  61-64
致谢  64

NRD1基因的生物信息学分析及其在P19细胞向心肌样细胞分化过程中的表达变化

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