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荧光定量PCR检测呼吸道标本中的人偏肺病毒

作　者: 吴栩
导　师: 陈志敏
学　校: 浙江大学
专　业: 儿科学
关键词: 人偏肺病毒荧光定量RT-PCR 直接免疫荧光法
分类号: R725.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景：2001年,荷兰学者Van Den Hoogen等首先报告从患呼吸道感染的婴幼儿标本中分离到一种新的病毒,根据序列同源性和基因群分析,该病毒分类为副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属,并命名为人偏肺病毒(human metapeumovirus,HMPV)。自2001年发现至今,HMPV已在欧洲(荷兰、瑞典、意大利、保加利亚),美洲(乌拉圭、美国),亚洲(新加坡、中国、日本)非洲(南非)等地陆续报道,表明HMPV呈全球流行,并提示HMPV是社区获得性呼吸道感染的常见病原。但HMPV在呼吸道感染患儿中的检出率各地差异较大,日本较低2.5%,保加利亚高达16%。目前有三种HMPV的检测方法：包括抗原抗体检测、病毒细胞培养和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。病毒细胞培养较难,所需时间较长,临床标本检出率较低。虽然血清学方法运用并不难,但现有血清学检测试剂用于检测临床标本HMPV敏感性低。HMPV的抗原检测临床常用的有免疫荧光法、免疫色谱法(IC)和酶免疫分析法(EIA),但敏感性和特异性仍嫌不足。目前RT-PCR技术是诊断HMPV感染的主要手段。可根据HMPV的核壳体蛋白基因N、基质基因M、融合基因F、多聚酶基因L、蛋白基因P等不同基因序列设计引物用于检测HMPV.而即时RT-PCR具有敏感性更高、更为经济省时等优点,扩增时环境污染的可能性更低。目的：观察比较实时荧光定量RT-PCR与直接免疫荧光检测技术检测呼吸道标本HMPV的特异性、灵敏度,旨在探讨实时荧光定量RT-PCR检测儿童HMPV方法的临床应用前景。方法：用]ONAstar比对分析HMPV的全基因组序列,寻找可供PCR扩增的保守片断,分别设计引物：primerF:5’-GTCTCTTCAAGGGATTCACC-3和primerR 5’-GTTGTTGTGCCTACATCTC-3,探针TaqMan 5’-FAM -CATGCTATATTA AAAGAGTCTCA-TAMRA-3’.探针的5’端由FAM标记,3’端由TAMRA标记。建立检测HMPV荧光定量PCR的方法。分别用建立的实时荧光定量RT-PCR与直接免疫荧光检测技术检测623例浙江大学医学院附属儿童医院呼吸内科病房2009年12月至2010年3月住院下呼吸道感染患儿HMPV的感染情况。比较两种方法检测儿童HMPV的特异性与灵敏度。结果：1.以HMPV作为模板进行荧光定量PCR获得阳性结果,但对其它常见呼吸道病毒(腺病毒,A型流感病毒,B型流感病毒,副流感病毒1型,副流感病毒2型,副流感病毒3型,呼吸道合胞病毒)及其它病毒PCR均阴性。2.在623例样本中直接免疫荧光法检出HMPV感染共10例,检出率1.61%。荧光定量PCR检出HMPV感染共28例,检出率4.49%,两种方法检出率有统计学差异(χ2=16.05,P<0.01)。CT值小于28直接免疫荧光法才能检出HMPV。3.直接免疫荧光法阳性者10份PCR均阳性,595份两者均阴性,18份标本直接免疫荧光法阴性PCR呈阳性,显示很好的相关性(r=0.589,P<0.01)。4.哮喘患儿中HMPV检出率为15.4%(4/26),显著高干肺炎组(20/515,3.9%)、毛细支气管炎组(4/46,8.7%),气管支气管炎组(0/36,0%)差异具有统计意义(χ2=11.217,P=0.011)5.HMPV检出率与年龄有关,0-1岁阳性率2.2%(9/404), -3岁13.1%(16/122),-6岁3.4%(2/58),>6岁2.6%(1/39),其中1-3岁年龄组患儿HMPV检出率明显高于其它组,统计学差异显著(χ2=26.443,P=0.000)结论：1选择HMPV N基因保守区域自行设计了一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HMPV荧光定量PCR的方法；2荧光定量RT-PCR检测HMPV敏感性明显高于直接免疫荧光法,具有快速、准确的优点；3哮喘患儿中HMPV检出率明显高于肺炎患儿；4 HMPV感染以1-3岁幼儿发生率最高。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-8
Abstract  8-12
目次  12-13
引言  13-15
1 研究对象与方法  15-19
  1.1 研究对象  15
  1.2 材料  15-16
  1.3 实验方法  16-19
2 实验结果  19-26
  2.1 临床资料  19
  2.2 PCR试验的实验室研究  19-23
  2.3 PCR试验与直接免疫荧光检测的比较研究  23-24
  2.4 HMPV阳性标本在不同呼吸道疾病间的分布情况  24
  2.5 HMPV感染患儿的年龄分布  24-26
3 讨论  26-31
4 结论  31-32
参考文献  32-35
综述  35-44
  参考文献  41-44
作者简历及在学期间发表的文章  44

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