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非小细胞肺癌患者外周血微转移意义研究

作　者: 刘小青
导　师: 任宏轩；伍治平
学　校: 昆明医学院
专　业: 肿瘤学
关键词: 非小细胞肺癌外周血微转移分子标记物荧光定量 RT-PCR ROC曲线
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的:肺癌是当今世界常见的恶性肿瘤之一,我国肺癌发病率也逐年增高,尤其是云南宣威、个旧的肺癌高发于全国的平均水平。虽然近年来肺癌外科治疗的效果有所提高,同时放疗、化疗、方案的日趋成熟,基因、生物治疗技术的开展,使肺癌的综合治疗达到了一个新的水平,但令人遗憾的是,患者远期治疗效果仍不尽人意,研究表明不易为常规临床检查所发现的局部微转移是引起肿瘤复发和转移的重要原因。因此要从总体上提高肿瘤的疗效,一方面要做到早期诊断,早期治疗,另一方面也要强调在首次治疗时就应判断患者肿瘤复发、转移的风险,并考虑如何预防或及时治疗肿瘤复发转移,在本实验中,利用CK19、LUNX、MUC1三个基因作为分子标志监测非小细胞肺癌患者外周血微转移,旨在建立一种非侵袭性、简单而有效的方法,用于临床上非小细胞肺癌患者筛检、诊断以及术后微转移状况的预测。方法:(1)检测非小细胞肺癌患者外周血中循环性癌细胞(Circulating TumourCells CTCs)的出现并评估其与临床病理特征的相关性,采用Trizol法抽提外周血总RNA,应用巢式RT-PCR技术检测60例非小细胞肺癌患者外周血中靶基因的表达,并以15例肺良性疾病患者及20例健康人外周血作为对照,以β-actin为内参照,分析非小细胞肺癌患者外周血中CK19mRNA、MUC-1mRNA及LUNXmRNA的表达,探讨其作为肺癌微转移检测分子标记物的可能性及与临床病理学特征的相关性。(2)在第一部分基础上,利用荧光定量PCR技术,采用相对定量的方法,扩增、定量60例非小细胞肺癌患者和60例健康志愿者外周血中CK19mRNA的表达量值。利用受试者工作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic,ROC曲线)对试验结果进行分析,确定CK19临床诊断的诊断试验效果临界值(cut off value)。结果:(1)本研究使用巢式RT-PCR技术,其灵敏度可达到10~6,结果表明:CK19mRNA、MUC-1mRNA及LUNXmRNA表达的阳性率为:51.6%(31/60)、80.0%(48/60)及55%(33/60)。对照组中15例肺良性疾病患者及20例健康人外周血中无LUNXmRNA表达,20例健康人外周血中有1例CK19mRNA表达,而MUC-1mRNA表达的阳性率在15例肺良性疾病患者中为60%(9/15),在20例健康人外周血中为65%(13/20)。(2)利用ROC曲线分析CK19mRNA荧光定量的结果,表明其诊断试验效果临界值为0.3031,灵敏度达91%、特异度为80.1%。结论:(1)使用巢式RT-PCR技术来检测非小细胞肺癌患者外周血中循环性癌细胞是可行的并具有高灵敏度和特异度。(2)CK19mRNA、LUNXmRNA作为检测非小细胞肺癌患者外周血微转移的分子标记物具有良好的敏感性和特异性,而MUC-1mRNA作为诊断非小细胞肺癌微转移的指标还需进一步探讨。(3)建立了利用荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌忠者外周血微转移癌细胞的方法体系。(4)利用ROC曲线分析的出CK19mRNA的临床诊断参考指标。然而,这还需要进一步的大规模人群,长期的临床验证。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
第一部分前言  10-19
  1 研究背景  10-17
    1.1 非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)  10-12
    1.2 微转移的概念  12
    1.3 研究微转移的意义  12-13
    1.4 NSCLC微转移的检测方法  13-15
    1.5 NSCLC微转移检测的分子标记物  15-16
    1.6 NSCLC微转移的常用的检测途径  16-17
  2.本研究的社会意义及思路、技术路线  17-19
第二部分利用CK19、MUC-1、LUNX分子标志检测非小细胞肺癌患者外周血循环性癌细胞  19-37
  1 前言  19-28
    2.1 临床资料  19
    2.2 主要仪器  19-21
    2.3 主要试剂  21
    2.4 主要试剂配方  21-22
    2.5 试验方法  22-26
    2.6 RT-PCR扩增产物的分析  26-27
    2.7 RT-PCR灵敏度测试  27
    2.8 统计分析  27-28
  3 试验结果及讨论  28-31
    3.1 总RNA的鉴定  28
    3.2 三组分子指标巢式RT-PCR的检测结果及临床相关因素的分析  28-31
  4 补充试验  31-35
    4.1 方法  31-32
    4.2 实验设计  32
    4.3 巢式PCR扩增结果  32-34
    4.4 讨论  34-35
  5 小结  35-37
第三部分使用实时荧光定量PCR方法检测非小细胞肺癌患者外周血癌细胞  37-44
  1 前言  37-38
  2 材料与方法  38-41
    2.1 临床资料  38
    2.2 主要仪器及试剂  38
    2.3 实验方法  38-41
  3 实验结果  41-43
    3.1 熔解曲线的获得  41-42
    3.2 扩增效率的确定  42
    3.3 荧光定量PCR扩增靶基因的扩增曲线  42
    3.4 ROC曲线及CK19mRNA荧光定量PCR结果分析  42-43
  4 小结  43-44
第四部分今后研究的方向及需要解决的问题  44-46
  4.1 研究方向  44-45
  4.2 需要加强及解决的问题  45
  4.3 结论  45-46
参考文献  46-49
文献综述  49-54
发表文章情况  54-55
致谢  55

非小细胞肺癌患者外周血微转移意义研究

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