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RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测CSISV在SPF雏鸡体内分布

作　者: 朱国坡
导　师: 刘兴友
学　校: 河南科技学院
专　业: 预防兽医学
关键词: RT-PCR TaqMan荧光定量RT-PCR 鸡生长与免疫抑制综合征病毒病毒分布
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 55次
引　用: 2次
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内容摘要

鸡生长与免疫抑制综合征病(暂命名,Chicken Stunt and Immunosuppression Syndrome Virus)是造成家禽生长和免疫抑制的重要传染性病之一。本课题在前期研究的基础上,应用RT-PCR和TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对SPF雏鸡人工感染后病毒在鸡体内的分布进行了研究,旨在找到病毒的亲嗜器官和在鸡体内的生长规律。根据CSISV全基因序列设计出了一对大小为540bp引物F1/F2、一对大小为117bp引物F3/F4及一条特异性探针。运用已建立的RT-PCR方法研究7日龄SPF雏鸡人工感染CSISV-ZZ2004毒株后病毒在鸡体内的分布和排毒情况。结果表明,病毒感染后在SPF雏鸡所有15个器官中均检测到了病毒,感染后最先于第9h在肺脏、气管和直肠中检测到病毒核酸,最晚于第120h在心脏中检测到病毒核酸;408h后所有组织均呈病毒核酸阴性。感染后能检测到病毒核酸阳性持续时间最长的是胰腺(384h),持续时间最短的是心脏(72h)。CSISV病毒具有广泛的组织嗜性,胰腺、法氏囊、肾脏、肺脏、直肠、胸腺、盲肠病毒持续时间都在288h以上,为病毒重要的靶器官。人工感染后第12h到第720h SPF雏鸡能持续地排毒。运用建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法对上述SPF雏鸡各器官病毒的含量进行了测定。结果表明,人工感染后所有组织中病毒核酸的最低含量均在1.57E+06 copies/μL以上,各组织中的病毒核酸含量均呈现先上升后下降的趋势,并均于72h～168h出现峰值;人工感染后48h～216h肾脏、法氏囊、肺脏、气管、腺胃、盲肠、直肠中病毒核酸含量均高于其他组织,拷贝数都在1.00E+08以上,说明这些器官是病毒复制的主要器官。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
第一章文献综述  11-29
  1 RT-PCR 技术的研究进展及应用  11-15
    1.1 RT-PCR 技术简介  11-12
    1.2 RT-PCR 反转录酶的选择  12-13
    1.3 RT-PCR 引物设计原则  13-14
    1.4 RT-PCR 技术在动物、植物病毒病检测中的应用  14-15
  2 实时荧光定量PCR 研究进展及应用  15-24
    2.1 荧光定量PCR 简介  15-16
    2.2 实时荧光定量PCR 定量原理  16-17
    2.3 荧光PCR 的分类  17-21
      2.3.1 荧光染料法  17-19
      2.3.2 荧光探针法  19-21
    2.4 实时荧光定量PCR 技术的两种定量形式  21-22
    2.5 荧光PCR 仪  22
    2.6 荧光定量PCR 技术的应用  22-24
      2.6.1 在动物病原微生物检测上的应用  22-23
      2.6.2 基因表达差异分析  23-24
      2.6.3 基因分型和突变分析  24
      2.6.4 肿瘤研究中的应用  24
  3 鸡生长与免疫抑制综合征（CSIS）研究进展  24-29
    3.1 流行病学和临床症状  24-25
    3.2 病毒的结构形态  25
    3.3 病毒的生长特性  25-26
      3.3.1 病毒在SPF 鸡胚上的生长特性  25-26
      3.3.2 病毒在细胞上的生长情况  26
    3.4 病毒鉴定  26-27
    3.5 病毒对肉仔鸡生长抑制的机理  27-28
    3.6 病毒检测方法的建立  28-29
引言  29-31
第二章 RT-PCR 方法检测CSISV 在SPF 雏鸡体内的分布  31-47
  1 材料和方法  31-37
    1.1 材料  31-33
      1.1.1 病毒  31
      1.1.2 试验动物  31
      1.1.3 主要试验仪器  31-32
      1.1.4 主要试剂  32
      1.1.5 主要试剂的配制  32-33
    1.2 方法  33-37
      1.2.1 病毒的复壮  33
      1.2.2 鸡胚病毒尿囊液的处理  33
      1.2.3 阳性模板RNA 的抽提及cDNA 的制备  33-34
      1.2.4 试验动物的饲养和管理  34
      1.2.5 试验动物的分组和攻毒  34-35
      1.2.6 试验样品的采集  35
      1.2.7 试验样品的处理  35
      1.2.8 样品中模板RNA 的抽提和合成  35
      1.2.9 RT-PCR 方法检测CSISV 在SPF 鸡体内的分布及排毒情况  35-37
  2 结果与分析  37-42
    2.1 鸡胚尿囊液病毒RT-PCR 检测结果  37-38
    2.2 CSISV 在SPF 雏鸡体内的分布  38-41
    2.3 人工感染后SPF 鸡的排毒情况  41-42
  3 讨论  42-45
    3.1 RT-PCR 方法检测人工感染SPF 鸡后CSISV 的动态分布  42-44
    3.2 人工感染后SPF 雏鸡的排毒情况  44-45
  4 小结  45-47
第三章 CSISV 在SPF 鸡各器官中的定量测定  47-69
  1 材料和方法  47-50
    1.1 材料  47-48
      1.1.1 病毒  47
      1.1.2 试验动物  47
      1.1.3 主要试验仪器  47
      1.1.4 主要试剂  47
      1.1.5 主要试剂的配制  47-48
    1.2 方法  48-50
      1.2.1 病毒的复壮  48
      1.2.2 鸡胚病毒尿囊液的处理  48
      1.2.3 阳性模板RNA 的抽提及cDNA 的制备  48
      1.2.4 试验动物的饲养和管理  48
      1.2.5 试验动物的分组和人工感染  48
      1.2.6 试验样品的采集  48
      1.2.7 试验样品的处理  48
      1.2.8 组织样品中模板RNA 的抽提与cDNA 合成  48
      1.2.9 TaqMan 荧光定量RT-PCR 方法检测CSISV 在SPF 雏鸡体内的分布  48-50
  2 结果与分析  50-66
    2.1 标准曲线的建立  50-52
    2.2 TaqMan 荧光定量RT-PCR 方法检测CSISV 在感染雏鸡体内的分布  52-66
      2.2.1 CSISV 在每个组织器官内的增殖动态分布  57-65
      2.2.2 CSISV 在SPF 雏鸡体内组织嗜性的动态分布  65-66
  3 讨论  66-68
    3.1 关于样本中RNA 含量的损失  66
    3.2 试验结果与动态规律的关系  66-67
    3.3 TaqMan 荧光定量RT-PCR 方法检测CSISV 在SPF 雏鸡体内的分布  67-68
    3.4 TaqMan 荧光定量RT-PCR 与RT-PCR 检测CSISV 分布规律的比较  68
  4 小结  68-69
全文结论  69-71
参考文献  71-79
附图：各组织不同时间的RT-PCR 检测结果  79-109
致谢  109-110
攻读学位期间发表的学术论文  110

RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测CSISV在SPF雏鸡体内分布

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