学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪细胞因子检测方法的建立与初步应用

作　者: 郑霖
导　师: 章金刚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 细胞因子酶联免疫斑点试验荧光定量RT-PCR 猪繁殖与呼吸综合征病毒
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 198次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

细胞因子(Cytokine)是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质,细胞因子的检测可以用于多种疾病(感染、炎症、自身免疫病等)的辅助诊断及疫苗接种后的细胞免疫功能评价,对于研究病毒感染后病毒与宿主免疫系统相互作用机制也同样具有重要意义。细胞因子是一个庞大的体内功能群体,其检测方法很多。根据检测原理和技术手段,可将细胞因子的检测技术大致分为免疫学方法、生物学方法和分子生物学方法等三类。目前较为常用的有酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、荧光定量RT-PCR、细胞内细胞因子检测、酶联免疫吸附(ELISA)等。ELISPOT技术是在溶血空斑技术和ELISA技术基础之上建立起来的现代免疫学检测技术,实现了对细胞因子进行单细胞水平上的精确定量检测。目前ELISPOT技术在全球尚未完全标准化,研究人员必须采用最佳匹配的包被抗体和检测抗体、ELISPOT板、形成斑点的底物及其显色时间等,因此在实际操作中需对各个因素进行优化方能建立较为稳定的检测体系。荧光定量PCR技术是将特异的荧光基团加入到PCR反应体系中,根据对荧光信号的实时检测并做出精确的定量分析,目前该技术在病原体检测等方面已得到广泛应用。当前荧光定量主要包括SYBR Green I和TaqMan探针法两种。SYBR Green I是一种能够于双链DNA非特异结合的荧光染料,适用于所有引物的扩增,方法简便,成本较低,但荧光染料能够与dsDNA结合,因此能与引物二聚体或者非特异性扩增产物结合,需要和熔解曲线分析加以辨别去除影响。而TaqMan探针法是将带有荧光标记探针加入到PCR反应体系中,对引物设计要求更高,但同时检测的特异性更高,结果更为可靠。近年来,猪细胞免疫的研究逐渐引起人们的重视。猪是一种重要的经济动物。猪群易受多种传染病侵害,猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征(即猪蓝耳病)等都给世界各地的养猪业造成了极大的经济损失。了解病毒与猪免疫系统之间相互作用的机制,尤其是细胞免疫应答机制,既有助于防治猪病毒性疾病,也有助于对新型疫苗诱发的免疫效应进行评价。此外,猪也是重要的实验动物,猪在解剖、组织和生理生化等许多生物学指标上与人类非常相似,被认为是研究人类疾病最合适的实验动物模型。猪作为实验动物已常被用作异种移植排斥反应的模型,因此对其免疫系统及免疫应答情况的研究对于该方面的研究也具有重要意义。在本研究中,我们着重研究了猪细胞因子的检测方法。我们利用五指山小型猪这一实验用小型猪,建立了猪细胞因子的检测方法,包括猪IFN-γ的ELISPOT检测方法及猪IL-2、IL-4、IL-10的实时定量RT-PCR检测方法。在建立猪IFN-γ的ELISPOT检测方法时,我们选择了PVDF膜96孔板,然后分别优化了捕获抗体和检测抗体的浓度、上板细胞数目及刺激物浓度。结果显示,当捕获抗体和检测抗体的浓度分别为1：60、上板细胞数为2×105个／孔、刺激用病毒量为2×105TCID50时,获得了较为稳定的检测体系。在建立猪IL-2、IL-4、IL-10的实时定量RT-PCR检测方法时,我们首先以五指山小型猪cDNA为模板,扩增了猪IL-2、IL-4、IL-10的基因保守区,将其分别克隆入T载体中,构建了相应的重组质粒。然后将重组质粒分别进行10倍梯度稀释,将其作为质粒标准品构建了标准曲线。结果显示,各标准曲线的直线相关系数|r|均大于0.990,且扩增效率在90%～105%之间。对该检测方法进行了方法学评价,结果显示,该检测方法的敏感性较高,IL-4检测下限达到10~0copies/μL, IL-2、IL-10检测下限达到10~2copies/μL;重复性较好,批内重复性与批间重复性分析变异系数基本都小于5%。这些评价结果都进一步说明了我们所建立的定量RT-PCR检测方法的可靠性。在建立猪细胞因子检测方法的基础上,我们对其进行了初步应用。我们采用ELISPOT方法对PRRSV接种后第0、7、14、21天猪PBMC特异性分泌γ-干扰素情况进行了测定,结果发现,接种后各猪IFN-γ表达水平呈明显上升趋势,第21天时达到最高峰；未接种的各猪则表现出IFN-γ表达水平稳定无上升趋势。这说明猪感染高致病性PRRSV后PBMC分泌IFN-γ能力明显增强,高致病性PRRSV可诱导猪体内效应T细胞发挥抗感染的作用。同时,我们还对攻毒后细胞中IL-2、IL-4及IL-10 mRNA的表达情况进行了分析。用建立的方法检测高致病性PRRSV感染仔猪Taqman荧光定量PCR检测各样品中IL-2、IL-4、IL-10细胞因子mRNA表达量,同时扩增β-actin作为内参对照。采用双标准曲线法进行相对定量,根据测得的Ct值与标准曲线得到样品中对应的IL-2、IL-4、IL-10基因拷贝数,以β-actin作内参,分析各细胞因子mRNA的表达差异。结果显示,攻毒后某些猪的各细胞因子水平变化较大,而对照组相对变化较小。下一步还需增加样本数才可从中总结中变化规律。本研究将有助于病毒感染后猪体内免疫应答的研究,对于猪作为实验动物的比较医学研究也同样具有重要意义。

全文目录

缩略词表(Abbreviation)  6-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-14
材料与方法  14-25
  1. 材料  14-15
    1.1 检测样品和毒株  14
    1.2 工具酶和其他试剂  14
    1.3 主要溶液配置  14-15
    1.4 主要仪器  15
  2. 猪γ干扰素ELISPOT检测方法的建立  15-17
    2.1 猪外周血单个核细胞的制备  15
    2.2 ELISPOT检测中抗体的优化  15-16
    2.3 ELISPOT检测中上板细胞数的优化  16-17
    2.4 ELISPOT检测中刺激物浓度的优化  17
  3. 猪IL-2、IL-4、IL-10的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立  17-22
    3.1 PBMC总RNA的制备及cDNA第一链的合成  17-18
    3.2 猪IL-2、IL-4、IL-10、β-actin重组质粒的构建  18-22
    3.3 猪IL-2、IL-4、IL-10标准曲线的建立  22
    3.4 荧光定量RT-PCR方法的敏感性评价  22
    3.5 荧光定量RT-PCR方法的重复性评价  22
  4. 猪细胞因子检测体系的初步应用  22-25
    4.1 实验动物和样品采集  22-23
    4.2 ELISPOT检测猪Y干扰素  23-24
    4.3 TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪IL-2、IL-4、IL-10  24
    4.4 相对定量分析各细胞因子mRNA的表达差异  24-25
结果  25-42
  1. 猪γ干扰素ELISPOT检测方法的建立  25-26
    1.1 PBMC分离及细胞活力检测  25
    1.2 ELISPOT检测上板抗体浓度的优化结果  25
    1.3 ELISPOT检测上板细胞数的优化结果  25-26
    1.4 ELISPOT检测中刺激物浓度的优化结果  26
  2. 猪IL-2、IL-4、IL-10的Taqman荧光定量RT-PCR检测方法的建立  26-38
    2.1 猪IL-2、IL-4、IL-10、β-actin重组质粒的构建与鉴定  26-31
    2.2 猪IL-2、IL-4、IL-10标准曲线的建立  31-34
    2.3 猪IL-2、IL-4、IL-10荧光定量RT-PCR方法的敏感性评价  34-36
    2.4 荧光定量RT-PCR方法的重复性评价  36-38
  3. 猪细胞因子检测体系的初步应用  38-42
    3.1 ELISPOT检测猪γ干扰素结果  38-39
    3.2 相对定量分析各细胞因子mRNA的表达差异结果  39-42
讨论  42-46
参考文献  46-51
文献综述  51-58
发表论著  58-65
附录  65-66
个人简历  66-67
致谢  67

猪细胞因子检测方法的建立与初步应用

内容摘要

全文目录

相似论文