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纤维素酶的研究及在秸秆养鹿中的应用初探

作　者: 郝月
导　师: 杨翔华
学　校: 辽宁石油化工大学
专　业: 环境工程
关键词: 纤维素纤维素酶玉米秸秆饲料养鹿
分类号: S825
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

全世界每年大约形成1000~2000亿t植物有机物质,其中有一半是纤维素物质。我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿t,工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物。这些废弃物既没有得到充分的利用,又污染环境,因此合理开发和科学利用这一丰厚的天然资源是各国政府及科学家一直致力于且投入大量资金及人力进行研究开发的重点领域。而目前对农作物秸秆的利用还未达到令人满意的水平,其主要原因是缺乏对农作物秸秆这种天然纤维素完全降解的高活性菌株。利用产纤维素酶的微生物分解废弃物(如农作物秸秆)不仅可以减少污染,还可以节省能源。利用纤维素酶使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类所需的物质,具有积极的深远意义。到目前为止,纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、医等领域中,并取得了初步成效,特别是在饲用纤维素酶方面。我国对纤维素酶的研究虽然有几十年的历史,但由于纤维素酶活性不高,生产成本过高而导致其应用仍受到限制。因此选育高活性的纤维素酶是我国酶制剂研究的一项重要任务。我国是一个农业大国,秸秆资源非常丰富,每年产量达数亿吨。但这丰富的秸秆资源在我国的利用率却很低。目前对秸秆的利用,仅限于还田以及掺入肥料发酵,这种利用无法解决大量秸秆的综合利用问题[1]。玉米秸秆是纤维组分含量很高的农作物残留物,若能将这些秸秆纤维废弃物经微生物转化为简单糖类或蛋白质等产品,既可以解决环境污染,又可以作为饲料,缓解粮食危机。因此,不断地分离和选育纤维分解高产菌株是一项重要而有意义的工作[2,3]。利用纤维素分解菌生产发酵饲料是当前饲料业的一个发展方向,它可将纤维素分解为牲畜可利用的糖,同时增加饲料中蛋白质的含量。本课题以碱处理过的辽丰2号玉米秸秆粉为原料,采用常规方法从山坡土壤、柴禾堆下及菜地等微生物丰富的土样中,大量采集并筛选分离后得出1株纤维素酶活性较高且性质较稳定的优良菌株,经初步鉴定为绿色木霉。采用摇床液体发酵试验方法,利用产纤维素酶菌株对秸秆进行发酵,并测定CMC酶活,FPA酶活,粗纤维及粗蛋白的含量,从而确定该菌株的最优产酶条件。液体发酵产酶特性的结果表明,最优培养基组成中秸秆和麦麸的比例为3:1,碳源总量为15g/L。培养基中1.7g/L硫酸铵和0.5g/L蛋白胨混合为实验的最佳氮源,最佳接种量为3%,最适酶解pH值为6.0,最适酶解温度为30℃,最佳培养时间为6d。此外,金属离子、维生素、表面活性剂等均是影响酶活性和纤维素分解率的重要因素。在优化培养条件的实验中,金属离子Na+对菌株产酶和纤维素的分解有明显促进的作用,而Cu2+则能明显抑制纤维素酶活性和纤维素的分解。添加维生素B2没有使酶活性提高,但却可以提高纤维素的分解率,使粗蛋白含量增加;而添加维生素C使酶活性和纤维素的分解率均明显升高。在培养介质中添加0.2%吐温-80(Tween-80)可以提高纤维素酶酶活和产率。此外,纤维素酶是一种诱导酶类,纤维素类物质的分解需要多种微生物的联合作用。在该菌株分别与酿酒酵母和青霉的混合共发酵实验中,纤维素酶活和对纤维素的分解能力均大幅度提高,粗蛋白含量也有所增加。其中以该菌株与青霉的混合效果最佳,说明青霉和木霉之间具有比较强的协同作用,可以相互补充,从而促进纤维素类物质的分解。本实验还将所选的绿色木霉与青霉混合制成种子液,在液体发酵罐中进行10升自控式批量发酵,搅拌速度控制在800r/min,30℃下培养6d后测得酶液的CMC酶活可达4.6955IU/mL,FPA酶活为1.4175 IU/mL,粗纤维的含量为11.01%,粗蛋白含量为20.66%,可以说是较理想的结果。以所得纤维素粗酶液喷洒的玉米秸秆和培养基残余物作为粗饲料的饲喂试验表明,该饲料可使成年公鹿60d平均增重29.56kg,平均日增重达492.71g,且产茸量也由1.3kg提高到1.44kg,鹿茸产量提高了10.77%。总之,本实验的研究结果对液态发酵生产纤维素酶有一定的指导作用,为农作物秸秆的开发利用提供了依据,也为草食动物饲料的研究开发奠定了基础。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-20
1 前言  20-22
2 文献综述  22-39
  2.1 降解秸秆的研究进展  22-24
    2.1.1 秸秆的主要成分  22
    2.1.2 降解秸秆的酶学机理  22
    2.1.3 微生物分解秸秆制剂的应用  22-23
      2.1.3.1 发酵法  22
      2.1.3.2 SCP 法  22-23
      2.1.3.3 酶解法  23
    2.1.4 秸秆饲料开发的状况  23-24
  2.2 纤维素的研究  24-25
    2.2.1 纤维素概述  24
    2.2.2 纤维素的化学组成及结构  24-25
  2.3 纤维素酶的研究  25-38
    2.3.1 纤维素酶的组成  25-26
      2.3.1.1 葡聚糖内切酶  25
      2.3.1.2 葡聚糖外切酶  25
      2.3.1.3 β-葡萄糖苷酶  25-26
    2.3.2 纤维素酶的分子结构与功能  26
    2.3.3 纤维素酶的降解  26-27
      2.3.3.1 对纤维素分子的吸附作用  26
      2.3.3.2 纤维素酶中单个组分的作用  26-27
      2.3.3.3 纤维素酶的协同降解作用  27
    2.3.4 纤维素酶的营养作用机理  27-28
      2.3.4.1 摧毁植物细胞壁，释放胞内养分  27
      2.3.4.2 补充草食动物内源酶的不足，刺激内源酶的分泌  27-28
      2.3.4.3 消除饲料中的抗营养因子  28
      2.3.4.4 对小肠的作用  28
      2.3.4.5 其他  28
    2.3.5 产纤维素酶微生物的研究  28-30
    2.3.6 纤维素酶的开发和生产  30-31
      2.3.6.1 菌株选育  30
      2.3.6.2 发酵培养  30-31
      2.3.6.3 酶提取  31
    2.3.7 饲用纤维素酶的应用方法  31
    2.3.8 纤维素酶研究的技术进展  31-33
      2.3.8.1 新菌株的选育  31-32
      2.3.8.2 产酶菌株的诱变育种  32
      2.3.8.3 DNA 体外重组技术  32
      2.3.8.4 基因定位突变技术  32-33
      2.3.8.5 细胞融合技术  33
    2.3.9 纤维素酶在饲料工业中的应用状况  33-36
      2.3.9.1 纤维素酶在畜牧生产中的应用现状  33-36
        2.3.9.1.1 在牛日粮中的应用  33-34
        2.3.9.1.2 在羊日粮中的应用  34
        2.3.9.1.3 在养猪业的应用  34-35
        2.3.9.1.4 在养禽业的应用  35-36
      2.3.9.2 纤维素酶在开发饲料资源方面的应用  36
        2.3.9.2.1 青贮饲料  36
        2.3.9.2.2 纤维素酶酶解纤维废弃物，生产单细胞蛋白  36
      2.3.9.3 在治疗方面的应用  36
    2.3.10 纤维素酶存在的问题及发展前景  36-38
      2.3.10.1 纤维素酶存在的问题  37
        2.3.10.1.1 饲用纤维素酶的检测方法有待进一步研究  37
        2.3.10.1.2 纤维素酶制剂的生产方法有待进一步研究  37
        2.3.10.1.3 纤维素酶的作用机制有待进一步研究  37
      2.3.10.2 纤维素酶研究展望  37-38
  2.4 实验目的及意义  38-39
3 实验部分  39-53
  3.1 实验原理  39-40
    3.1.1 菌种筛选原理  39
    3.1.2 发酵原理  39-40
  3.2 实验器材与材料  40-42
    3.2.1 实验器材  40
      3.2.1.1 主要仪器与设备  40
      3.2.1.2 实验器皿  40
    3.2.2 实验材料  40-42
      3.2.2.1 样品来源  40-41
      3.2.2.2 秸秆来源  41
      3.2.2.3 培养基  41
      3.2.2.4 蛋白质的测定  41
      3.2.2.5 滤纸分解度的观察  41
      3.2.2.6 CMC 酶活性的测定  41
      3.2.2.7 FPA 酶活性的测定  41-42
      3.2.2.8 天然纤维素酶活性的测定  42
      3.2.2.9 纤维素的测定  42
  3.3 实验方法  42-47
    3.3.1 高产纤维素酶菌株的筛选  42
      3.3.1.1 初筛  42
      3.3.1.2 增殖与复筛  42
      3.3.1.3 菌种的分离  42
    3.3.2 秸秆纤维素的制备  42-43
    3.3.3 酶活的测定  43
    3.3.4 菌株的初步鉴定  43
    3.3.5 菌株的传代试验  43
    3.3.6 供试菌种孢子悬液的制备和稀释  43
    3.3.7 考察发酵条件对酶解效果的影响  43-45
      3.3.7.1 培养时间对菌株酶解效果的影响  43
      3.3.7.2 碳源对菌株酶解效果的影响  43-44
      3.3.7.3 氮源对菌株酶解效果的影响  44
      3.3.7.4 接种量对菌株酶解效果的影响  44
      3.3.7.5 发酵起始pH 对菌株酶解效果的影响  44
      3.3.7.6 温度对菌株酶解效果的影响  44
      3.3.7.7 金属离子对菌株酶解效果的影响  44-45
      3.3.7.8 表面活性剂对菌株酶解效果的影响  45
      3.3.7.9 维生素对菌株酶解效果的影响  45
    3.3.8 纤维素分解菌之间的相互作用  45
    3.3.9 液体发酵罐扩大培养  45
    3.3.10 纤维素酶在饲养梅花鹿中的试验初探  45-47
      3.3.10.1 试验地点  45
      3.3.10.2 试验材料  45-46
      3.3.10.3 试验方法  46-47
  3.4 分析方法  47-53
    3.4.1 玉米秸秆成分的测定方法  47-48
      3.4.1.1 水分的测定方法  47
      3.4.1.2 灰分的测定方法  47
      3.4.1.3 蛋白质的测定  47-48
    3.4.2 还原糖含量的测定  48-51
      3.4.2.1 原理  48
      3.4.2.2 操作方法  48-50
      3.4.2.3 试剂的配制  50
      3.4.2.4 羧甲基纤维素（CMC）酶活的测定  50-51
      3.4.2.5 滤纸酶活（FPA）的测定  51
      3.4.2.6 天然纤维素酶活的测定  51
      3.4.2.7 滤纸分解度的观察  51
    3.4.3 纤维素的测定  51-53
      3.4.3.1 中性洗涤剂的配制  51-52
      3.4.3.2 操作方法  52-53
4 结果与讨论  53-78
  4.1 实验所用秸秆的原始成分测定  53
  4.2 纤维素分解菌的分离纯化结果  53-54
  4.3 酶活力测定结果  54-56
  4.4 H-6 菌株的初步鉴定  56-57
  4.5 传代试验  57
  4.6 发酵条件对酶解效果的影响  57-74
    4.6.1 培养时间对对酶解效果的影响  57-59
    4.6.2 碳源对酶解效果的影响  59-64
      4.6.2.1 不同含量的玉米秸秆对酶解效果的影响  59-61
      4.6.2.2 不同含量的麦麸对酶解效果的影响  61-62
      4.6.2.3 秸秆比例对液态混合培养酶解效果的影响  62-64
    4.6.3 氮源对酶解效果的影响  64-66
    4.6.4 接种量对酶解效果的影响  66-68
    4.6.5 pH 对酶解效果的影响  68-69
    4.6.6 温度对酶解效果的影响  69-71
    4.6.7 金属离子对酶解效果的影响  71-72
    4.6.8 表面活性剂（Tween-80）对酶解效果的影响  72-73
    4.6.9 维生素对酶解效果的影响  73-74
  4.7 不同菌株之间的相互作用  74-75
  4.8 液体发酵罐扩大培养  75-76
  4.9 纤维素酶在饲养梅花鹿中的试验初探  76-78
5 结论  78-80
参考文献  80-86
致谢  86-87
攻读学位期间发表的学术论文目录  87

纤维素酶的研究及在秸秆养鹿中的应用初探

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