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体细胞克隆繁育优秀种公猪技术的研究

作　者: 罗学明
导　师: 张子军；潘登科
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪体细胞核移植初次卵裂时间发育潜能
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

利用体细胞克隆技术可以大量复制优秀种公猪,实现优秀个体的快速繁育。国外已经在种公猪扩繁方面进行了有益的尝试。然而,种公猪克隆效率及克隆猪培育仍存在很大问题。本研究通过对初次卵裂时间与猪孤雌发育(parthenogen-esis, PA)和体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)两种胚胎发育潜能关系的探讨,找到了关于优质克隆胚胎在早期发育阶段的重要标识,进一步完善了体细胞克隆技术平台,提高克隆猪效率；针对新生克隆仔猪体质弱,成活率低等问题,加强饲养管理,培育出更多优秀的克隆种公猪,建立起一套切实可行的优秀种公猪快速繁育体系。结果如下：试验一：本研究根据北京市种猪性能测定、遗传评估结果挑选出优秀成年英系大白种公猪3头；无菌操作取耳部组织,采用常规组织块接种培养,建立了3个细胞系,并对所建细胞系的染色体倍性进行了研究,为克隆猪的生产及相关研究提供了充足的供体细胞。试验二：早期胚胎发育主要是由积累在卵母细胞胞质中的母源物质来调控,为了探明初次卵裂时间早晚与猪PA胚胎发育潜能的关系,本研究比较了不同初次卵裂时间(20-24 h,早期；25-36 h,中期；37-48 h,晚期；0-48 h,对照)的PA胚胎的囊胚率、扩张囊胚率和囊胚细胞数,评价其体外发育能力。发现早期卵裂的PA胚胎发育到第6d的囊胚比率显著高于中期、晚期以及对照组(P<0.05；54.2±3.9% vs.19.7±1.4%,5.5±0.6%,18.9±2.3%)；扩张囊胚发育率也具有同样的发育趋势。试验三：为了有效评价猪早期SCNT胚胎的后期发育能力,本研究探索初次卵裂时间早晚与猪SCNT胚胎发育潜能的关系。结果表明：早期卵裂的SCNT胚胎发育到第6d的囊胚率高于中期卵裂胚胎(32.6±3.9% vs.24.6±2.8%),而晚期卵裂胚胎发育到囊胚的比率最低(4.0±0.4%)。早期卵裂的SCNT胚胎发育到第6d的扩张囊胚率显著高于其余各组(P<0.05;19.0±3.9% vs.6.0±4.8%.0.8±0.2.7.4±0.8)。囊胚细胞数在早期、中期、晚期三组之间表现出下降趋势。试验四：胚胎移植是克隆技术环节中观察胚胎后期体内发育状况的重要环节。为进一步说明体细胞核移植早期卵裂胚胎的后期发育能力,本试验在移植环节上将早期卵裂的SCNT胚胎(第一组)与未经挑选的对照组胚胎(第二组)分别进行移植,观察其体内发育能力。结果显示：第一组718枚早期卵裂胚胎分别移植到6头受体母猪,产仔28头(1个死胎),窝产仔数最高达11头；第二组2719枚未经挑选胚胎移植到12头母猪,产仔25头(8个死胎,3个木乃伊)。移植早期卵裂SCNT胚胎的受体在平均产仔数和克隆效率上均明显高于未经挑选胚胎的受体(P<0.05；4.7 vs.2.1；3.9% vs.0.9%),说明早期卵裂胚胎着床后具有更强的体内发育能力。以上结果表明：利用体细胞克隆技术可以快速地繁育优秀种公猪；初次卵裂时间作为猪克隆胚胎发育潜能的重要标识,有效预测了早期胚胎的后期发育能力；选择早裂的SCNT胚胎进行移植,明显提高了克隆效率,并且为克隆技术及转基因育种产业化提供了重要的技术参考。

全文目录

摘要  3-5
Summary  5-7
目录  7-10
缩略词表  10-11
第一部分文献综述  11-25
  1 体细胞克隆猪研究现状及其应用  13-17
    1.1 体细胞克隆猪国内外研究现状  13
    1.2 克隆技术在养猪生产中的应用  13-14
    1.3 克隆技术在猪新品种培育中的应用  14-15
    1.4 克隆猪应用于生物反应器  15-16
    1.5 克隆猪在医学上器官移植,疾病模型的应用研究  16
    1.6 拯救濒危猪种  16-17
  2 初次卵裂时间与哺乳动物胚胎发育潜能关系的研究状况  17-19
    2.1 初次卵裂时间与人的体外受精胚胎发育潜能的关系  17
    2.2 初次卵裂时间与牛的体外受精胚胎发育潜能的关系  17
    2.3 影响哺乳动物胚胎初次卵裂时间因素的研究  17-19
  3 目前克隆猪技术存在的问题及其安全评价  19-23
    3.1 克隆效率低  19-20
    3.2 代孕母猪的妊娠期较长、难产较多  20
    3.3 克隆仔猪出生体重较小  20-21
    3.4 克隆猪出生后死亡率较高  21
    3.5 克隆猪安全评价  21-23
  4 本研究的目的和意义  23-24
    4.1 研究目的  23
    4.2 研究意义  23-24
  5 技术路线  24-25
第二部分试验研究  25-51
  第一节优秀种公猪的选择及其细胞系建立  25-32
    前言  25
    1 材料与方法  25-29
      1.1 试验材料  25-27
      1.2 试验方法  27-29
    2 结果  29-31
      2.1 成年优秀大白种公猪的选择结果  29
      2.2 大白猪耳成纤维细胞系建立结果  29-30
      2.3 细胞核型分析  30-31
    3 讨论  31-32
  第二节初次卵裂时间不同的猪孤雌胚胎体外发育  32-39
    前言  32
    1 材料与方法  32-36
      1.1 试验材料  32-35
      1.2 实验方法  35-36
    2 试验设计及数据分析  36
    3 结果  36-38
    4 讨论  38-39
  第三节初次卵裂时间不同的核移植胚胎体外发育  39-43
    前言  39
    1 材料与方法  39-41
      1.1 试验材料  39-40
      1.2 实验方法  40-41
    2 试验设计及数据分析  41
    3 结果  41-42
    4 讨论  42-43
  第四节胚胎移植及克隆仔猪鉴定  43-49
    前言  43
    1 材料和方法  43-44
      1.1 试验材料  43
      1.2 试验方法  43-44
    2 试验设计及数据分析  44
    3 结果  44-47
      3.1 早期卵裂核移植胚胎的移植结果  45-46
      3.2 未经挑选的核移植胚胎移植结果  46
      3.3 早期卵裂与未经挑选的核移植胚胎移植结果比较  46-47
      3.4 克隆猪、供体细胞和代孕母猪微卫星检测结果  47
    4 讨论  47-49
  第五节克隆种公猪的异常状况及其分析  49-51
    1 克隆种公猪出现的异常状况  49-50
      1.1 代孕母猪的妊娠期长、难产较多  49
      1.2 克隆仔猪出生体重较小  49-50
      1.3 其它异常状况  50
    2 克隆种公猪异常分析  50-51
第六节结论  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
导师简介  58-59
作者简历  59-61

体细胞克隆繁育优秀种公猪技术的研究

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