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专性自养极端嗜酸性硫杆菌高效表达载体的构建

作　者: 郝立凯
导　师: 刘相梅
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 生物冶金硫杆菌表达载体基因工程
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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引　用: 4次
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内容摘要

专性自养极端嗜酸菌硫杆菌（Acidithiobacillus）广泛分布在硫化矿床、酸性矿水及土壤中，在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等方面发挥着重要作用，同时在自然界的硫循环中也占有重要地位。作为自养细菌，这类硫杆菌具有生长缓慢，代时长，细胞得率低等特点，因此生产周期长，增加生产成本；其次，硫杆菌对某些重金属离子缺乏抗性，限制了它的实际应用，也给研究工作带来许多困难。因此，用遗传学方法改良这类细菌是当前该领域的一个重要课题。要想充分发挥生物冶金的功能，对其进行遗传改造势在必行。但是，随着硫杆菌遗传学和分子生物学研究的不断发展，已有的表达载体已经不能完全满足构建硫杆菌基因工程菌的要求，因此构建新的高效表达载体的任务变得越来越重要、越来越迫切。本论文以广泛宿主范围的R族（IncR）质粒pBBR1MCS-2为出发质粒，将来自于大肠杆菌的链霉素抗性基因和来自于水母的绿色荧光蛋白基因作为报告基因，构建了含有大肠杆菌强启动子P_tac的组成型表达载体pBBR-tac-Sm和pBBR-tac-EGFP，将其转入E．coli JM109中，并对其链霉素抗性和荧光蛋白基因的表达进行了检测，结果表明携带质粒pBBR-tac-Sm的E．coli JM109对链霉素的MIC（最大抑制浓度）提高到了12mg/ml，携带质粒pBBR-tac-EGFP的E．coli JM109荧光强度比对照E．coli JM109提高了8倍多，比携带基于实验室原有质粒pJRD215构建的重组质粒pJRD-EGFP的E．coli JM109荧光强度提高了3.26倍。使用接合转移方法将构建的重组质粒pBBR-tac-Sm转入几株不同的专性自养极端嗜酸性硫杆菌中，通过由IncP类群质粒RP₄的带动，以E．coli C600为受体菌进行的反向接合实验及反向接合转移子质粒DNA的提取进行了验证，证实表达载体成功转入了不同硫杆菌中。在无选择压力条件下将其连续传代50代，表达质粒可保留63％以上，说明表达载体能在硫杆菌中稳定存在。通过测定构建的硫杆菌基因工程菌在不同浓度链霉素条件下的最大生长量和生长曲线，证明其抗链霉素特性较含其他质粒的硫杆菌得到了明显的提高，其MIC提高至8.0mg/ml。本实验首次以pBBR1MCS-2为出发质粒，成功地构建了能在E．coli与硫杆菌之间进行接合转移的、广泛宿主范围、高效表达外源基因的质粒载体，并将其通过接合导入硫杆菌中。为改造浸矿细菌，提高铁、硫氧化细菌的浸矿能力提供了合适、高效的外源基因表达载体。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语  11-12
第一章绪论  12-32
  1.1 细菌表达载体概论  12-24
    1.1.1 原核表达载体的基本要素  12-15
      1.1.1.1 稳定的遗传复制子  12-13
      1.1.1.2 显性的筛选标记  13-14
      1.1.1.3 可调控的原核强启动子  14
      1.1.1.4 强转录终止信号  14-15
      1.1.1.5 SD序列  15
      1.1.1.6 多克隆位点  15
    1.1.2 质粒生物学  15-23
      1.1.2.1 质粒的宿主范围  16-17
      1.1.2.2 质粒拷贝数和复制  17-20
      1.1.2.3 质粒的分配和分离稳定性  20
      1.1.2.4 质粒的不相容性  20-22
      1.1.2.5 质粒的接合转移  22-23
    1.1.3 基因表达的调控  23-24
  1.2 生物冶金技术  24-27
    1.2.1 生物冶金技术简介  24-26
    1.2.2 生物冶金中的浸矿微生物  26-27
  1.3 专性自养极端嗜酸性硫杆菌遗传改造研究概论  27-31
    1.3.1 专性自养极端嗜酸性硫杆菌基因转移系统的研究  28-29
    1.3.2 专性自养极端嗜酸性硫杆菌的遗传改良  29-31
  1.4 本论文的研究意义及内容  31-32
第二章广泛宿主范围高效表达质粒载体的构建  32-47
  2.1 引言  32-33
  2.2 材料与方法  33-37
    2.2.1 菌株与质粒  33-34
    2.2.2 培养基和培养条件  34
      2.2.2.1 LB培养基  34
      2.2.2.2 麦康凯培养基  34
    2.2.3 抗生素使用浓度  34
    2.2.4 DNA操作技术  34-37
      2.2.4.1 质粒DNA的提取  34-35
      2.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳  35
      2.2.4.3 DNA浓度、纯度和DNA分子量的测定  35
      2.2.4.4 限制性核酸内切酶酶切  35
      2.2.4.5 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收  35-36
      2.2.4.6 连接  36
      2.2.4.7 质粒DNA的转化  36
      2.2.4.8 PCR技术  36-37
    2.2.5 菌种保藏  37
  2.3 实验结果  37-47
    2.3.1 表达载体pBBR-tac-Sm和pBBR-tac-EGFP的构建  37-43
      2.3.1.1 表达载体pBBR-tac-Sm的构建  37-40
      2.3.1.2 表达载体pBBR-tac-EGFP的构建  40-43
    2.3.2 表达载体的报告基因在大肠杆菌中的表达  43-47
      2.3.2.1 表达载体pBBR-tac-Sm的报告基因在大肠杆菌中的表达  43-45
      2.3.2.2 表达载体pBBR-tac-EGFP的报告基因在大肠杆菌中的表达  45-47
第三章表达载体在专性自养极端嗜酸性硫杆菌中的表达研究  47-58
  3.1 引言  47
  3.2 材料和方法  47-51
    3.2.1 菌株和质粒  47-48
    3.2.2 培养基和培养条件  48-49
      3.2.2.1 大肠杆菌  48
      3.2.2.2 硫杆菌  48-49
      3.2.2.3 大肠杆菌—硫杆菌接合培养基及菌体洗涤液  49
    3.2.3 抗生素使用浓度  49
    3.2.4 大肠杆菌和硫杆菌的接合转移  49-50
      3.2.4.1 供体菌及受体菌的准备  49
      3.2.4.2 大肠杆菌与硫杆菌的接合  49-50
      3.2.4.3 接合转移子的鉴定  50
      3.2.4.4 提取质粒鉴定  50
      3.2.4.5 反向接合转移  50
    3.2.5 质粒稳定性测定  50
    3.2.6 DNA操作技术  50
    3.2.7 菌种保藏  50-51
  3.3 实验结果  51-58
    3.3.1 表达载体pBBR-tac-Sm从大肠杆菌到硫杆菌中的接合转移  51
    3.3.2 表达载体pBBR-tac-Sm从硫杆菌向大肠杆菌的反向接合转移  51-52
    3.3.3 表达载体pBBR-tac-Sm在硫杆菌中稳定性测定  52-53
    3.3.4 表达载体pBBR-tac-Sm在硫杆菌中的表达  53-58
总结与讨论  58-60
参考文献  60-64
致谢  64-65
学位论文评阅及答辩情况表  65

专性自养极端嗜酸性硫杆菌高效表达载体的构建

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