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转hTNF-α基因在鱼腥藻7120中表达产物的提取及其纯化

作　者: 牛黎莉
导　师: 郭玉蓉；施定基
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 培养藻细胞破碎提取缓冲液纯化离子交换层析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

蓝藻属光合自养生长,培养条件简单,成本低廉,只需光、CO2、无机盐和合适的温度就能生长,适于大规模生产。用蓝藻为表达宿主制备hTNF-α口服保健品,可以避免大肠杆菌产生内毒素、表达产物生成包涵体等弊端,能降低下游生产成本。人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factorα,hTNF-α)对肿瘤组织和肿瘤细胞有特异的杀伤作用,是迄今为止唯一能够直接杀死肿瘤细胞的天然因子,可能成为极有前景的抗癌药。本文用5L瓶培养转hTNF-α基因的鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120),进行藻体破碎及一系列处理分离和纯化hTNF-α,得到了从转基因鱼腥藻中获得一定纯度hTNF-α的优化条件。实验结果如下:1.用装有4LBG-11培养液的5L大瓶,培养转hTNF-α基因的鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120),90μmol/m2.s-1光照下培养,其24d时表达量最高,是收集藻细胞的最佳时期。2.通过提取缓冲液及蓝藻细胞破碎方法的筛选,得出hTNF-α的最佳溶出条件为:0.05 mol/L的pH7.5Tris-HCl缓冲液,NaCl 0.2 mol/L,EDTA0.01mol/L;超声波法破碎最佳条件:超声功率为800W,间歇时间为1s,工作时间为0.5s,湿藻与破碎液的质量体积比为1:15,总超声时间为8min,超声一次;冻融处理的最佳条件:体积最好<1.5mL,先在-20℃冻存过夜(12h),融化后离心取上清,然后再在藻体中加入同样体积的破碎缓冲液-20℃冻2h,融化后离心取上清,两次上清合并。3.用温度和盐析对粗提液进行初步纯化,确定出最佳的处理温度为:55℃处理30min;最佳的盐析条件为:蛋白浓度为1.2～1.8mg/mL,最好接近1.8mg/mL,温度为4～18℃,硫酸铵分级沉淀范围为:30%～60%,pH为6.5;最佳的初步纯化工艺为:将蛋白粗提液先用30%饱和度的硫酸铵处理1h后,然后直接用温度55℃处理30min,12,000r/min离心30min,将上清再用60%饱和度的硫酸铵处理1h,12,000r/min离心30min收集沉淀hTNF-α,用上柱缓冲液溶解。其hTNF-α回收率能达到86.83%,并可将约91.2%的杂蛋白去除,纯度达到4.54%,纯化倍数为9.880。4.离子交换层析:比较了几种离子交换填充柱材料的纯化效果;最后选择

全文目录

摘要  2-4
Summary  4-7
缩略词表  7-8
文献综述  8-18
1. 前言  18-20
2. 材料和方法  20-31
  2.1 实验材料  20-21
  2.2 实验方法  21-28
  2.3 测定方法  28-31
3. 结果与分析  31-48
  3.1 转基因藻的生理特性以及生物量  31-34
  3.2 转基因鱼腥藻1802 的破碎  34-36
  3.3 细胞破碎缓冲液的筛选  36-38
  3.4 1802 中HTNF-Α的初步纯化  38-44
  3.5 离子交换层析  44-48
4 讨论  48-53
  4.1 破碎方法对HTNF-Α含量的影响  49-50
  4.2 细胞破碎缓冲体系对HTNF-Α含量的影响  50
  4.3 温度对HTNF-Α稳定性的影响  50-51
  4.4 盐析各参数对HTNF-Α纯化的影响  51-52
  4.5 材料前处理对HTNF-Α纯化的影响  52-53
  4.6 离子交换层析条件对HTNF-Α纯化的影响  53
5 结论  53-55
致谢  55-56
参考文献  56-62
个人简历  62-63
导师简介  63-65

转hTNF-α基因在鱼腥藻7120中表达产物的提取及其纯化

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