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在未分化的人骨髓间充质干细胞内鉴定调节Nanog基因表达的顺式调控元件

作　者: 刘伸琴
导　师: 魏星
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 骨髓间充质干细胞 Oct4 Nanog Sox2 顺式调控元件
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,骨髓MSCs)具有自我扩增和多向分化潜能,具有易分离、扩增快以及体外操作简便等特点,使其在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景。目前对骨髓MSCs生长调节机理研究的很少,很有必要深入研究骨髓MSCs的自我更新机制。本论文试图鉴定调节Nanog基因表达的顺式调控元件,并且研究关键转录因子Oct4和Sox2在调节Nanog基因表达中的作用。双荧光报告素酶实验表明,在未分化的人骨髓MSCs中,Nanog基因片段(自-380bp至+24bp)能够被激活,能够活化报告基因萤火虫荧光素酶的表达,但在由骨髓MSCs诱导分化的成骨细胞中,此Nanog基因片段不能被激活。另外,将含有绿色荧光蛋白报告基因的质粒转染入细胞内后,在未分化的人骨髓MSCs中,此Nanog基因片段能够活化绿色荧光蛋白的表达。这些研究结果表明此Nanog基因片段(自-380bp至+24bp)含有顺式调控元件,能够在未分化的人骨髓MSCs中被激活。RT-PCR研究表明,未分化的人骨髓MSCs能够表达Oct4基因,并且能够表达少量Sox2,但由骨髓MSCs诱导分化的成骨细胞不能表达Oct4和Sox2。上述Nanog基因片段(自-380bp至+24bp)含有可与转录因子Oct4和Sox2结合的核苷酸顺序,凝胶迁移实验显示,在未分化的人骨髓MSCs中,转录因子Oct4和Sox2不能够与此核苷酸顺序结合,说明虽然Oct4和Sox2基因能够在未分化的人骨髓MSCs内表达,转录因子Oct4和Sox2可能不能在此细胞内调节Nanog基因的表达。在未分化的胚胎干细胞(embryonic stem cells)中,Oct4和Sox2对Nanog基因的表达起到重要作用,此研究表明,与胚胎干细胞不同,Oct4和Sox2在未分化的人骨髓MSCs内不能够活化Nanog基因,其他的未知转录因子可能能够活化Nanog基因的表达。本实验的结果具有重要的理论和应用价值,为进一步研究人骨髓MSCs的自我更新及分化机制提供了依据,不但有利于促进MSCs生长,也有利于控制MSCs的定向分化,有利于将MSCs应用于组织工程。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-5
主要符号对照表  5-8
第一章 前言  8-12
  1.1 骨髓MSCs概述  8-10
    1.1.1 骨髓MSCs的分离和培养  8-9
    1.1.2 骨髓MSCs的生物学特性  9
    1.1.3 骨髓MSCs的体外成骨诱导分化  9-10
  1.2 转录因子Oct4 与Nanog在ES细胞中的调控研究  10-11
    1.2.1. Nanog与干细胞  10
    1.2.2. Oct4 与干细胞  10-11
  1.3 研究背景，目的和意义  11-12
第二章 实验材料与方法  12-29
  2.1 实验材料  12-15
    2.1.1 主要试剂和原料  12-13
    2.1.2 主要仪器设备  13
    2.1.3 常用溶液及其配制  13-14
    2.1.4 菌种和细胞株  14-15
  2.2 实验方法  15-29
    2.2.1 人骨髓MSCs原代细胞的分离培养  15
    2.2.2 人骨髓MSCs的保存和复苏  15
    2.2.3 人骨髓MSCs的鉴定  15-16
    2.2.4 诱导人骨髓MSCs分化成成骨细胞  16
    2.2.5 成骨细胞分化鉴定  16
    2.2.6 人基因组DNA的提取  16-17
    2.2.7 制备感受态细胞  17
    2.2.8 小量抽提质粒  17-18
    2.2.9 中量抽提质粒  18-20
    2.2.10 纯化DNA  20-21
    2.2.11 DNA凝胶回收  21-22
    2.2.12 质粒转化  22
    2.2.13 双荧光报告素酶报告质粒的构建  22-23
    2.2.14 绿色荧光蛋白报告质粒的构建  23-24
    2.2.15 脂质体转染  24-25
    2.2.16 双荧光素酶报告实验  25
    2.2.17 总RNA提取  25-26
    2.2.18. RT-PCR检测Oct4 和Sox2 表达情况  26
    2.2.19 绿色荧光蛋白实验  26
    2.2.20 核蛋白提取  26-27
    2.2.21 生物素标记探针  27
    2.2.22 斑点杂交检测探针标记效率  27-28
    2.2.23 凝胶电泳迁移率实验  28-29
第三章 实验结果  29-39
  3.1 人骨髓MSCs的原代培养  29
  3.2 人骨髓MSCs的鉴定  29-30
  3.3 成骨细胞分化鉴定  30-31
  3.4 提取人基因组DNA  31-32
  3.5 双荧光素酶检测Nanog调控元件在骨髓MSCs内的活性  32-35
  3.6 绿色荧光蛋白实验检测Nanog调控元件在骨髓MSCs内的活性  35-36
  3.7 RT-PCR检测Oct4 和Sox2 表达情况  36-37
  3.8 斑点杂交检测探针标记效率  37
  3.9 EMSA检测Oct4 与Sox2 是否激活Nanog顺式调控元件  37-39
第四章 讨论  39-41
第五章 结论  41-42
参考文献  42-45
致谢  45-46
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  46

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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