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猪SLA抗原递呈相关新基因的克隆及功能分析

作　者: 李波
导　师: 李学伟；李华
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: SLA-DMB基因 LMP2基因 抗原递呈 克隆 多态分析 功能分析
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 121次
引　用: 4次
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内容摘要


猪SLA-DMB基因和LMP2基因是参与SLA Ⅰ、Ⅱ类抗原递呈的两个重要功能基因，对其进行克隆测序及遗传变异研究，可以为研究猪免疫应答抗原递呈机理和开展猪抗病育种工作提供基因数据和相关基因多态性信息。本文以人基因cDNA序列为信息探针，对猪EST数据库进行同源检索筛选，电子克隆猪相关新基因，分析功能区外显子的遗传变异并预测其蛋白质的结构及功能，旨在根据物种间同源基因序列，建立一条跨物种电子克隆新基因的有效途径。研究结果如下： 1 SLA-DMB基因的克隆及分析 以人HLA-DMB基因cDNA序列为信息探针，对猪EST数据库进行同源检索筛选，克隆了猪SLA-DMB基因的cDNA序列，片断全长1456bp。通过NCBI的ORF finder服务器对所获得的cDNA序列进行开放阅读框架(ORF)分析，结果发现其开放阅读框架推测编码263个氨基酸。为了验证电子克隆序列的正确性，在其起始密码子区域和终止密码区域设计特异引物，经RT-PCR进行克隆、序列分析验证，结果表明与电子克隆序列完全一致(GenBank登录号为DQ431246)。通过序列同源比对及系统发育进化分析，发现克隆到的序列与其他物种DMB基因具有很高的同源性。应用生物信息学的方法对SLA-DMB基因编码氨基酸进行蛋白质基本性质、结构及功能预测，结果显示SLA-DMB分子是一种具有信号肽序列，靠近N端木端存在一个跨膜结构的MHCⅡ类β分子前体蛋白。 2 SSCP分型的方法学探讨及DM类基因的多态性研究 以藏猪主要组织相容性复合体(SLA)Ⅱ类区域DMA基因第3外显子多态分析为切入点，通过利用低离子强度单链构缘多念性分析技术(LIS-PCR-SSCP)分析、分子克隆测序、菌落PCR、菌落不对称PCR及单链DNA二级结构计算机预测等技术，对SSCP电泳图谱复杂带型进行分析。结果表明：SSCP基因分型与单链DNA二级结构计算机预测结果之间存在很高的一致性，从而建立了一种快速且准确的分型方法，并拓展了SSCP的应用领域。在SSCP新方法的基础上结合DNA池产物直接测序技术，对SLA-DM类其他第2、3外显子进行多态扫描，结果发现这些区域皆高度保守。在减猪、合作猪、巴马猪及五指山猪4个群体中，分析SLA-DMA第3外显子的2种等位基因的基因型和基因频率，并比较了各基因型在不同猪群的分布差异。3猪LMP2基因的克隆、原核表达及分析 以人LMP2基因cDNA序列为信息探针，对猪EST数据库进行同源检索筛选，克隆了猪LMP2基因的cDNA序列，片断全长1189bp。通过NCBI的ORF finder服务器对所获得的cDNA序列进行开放阅读框架(ORF)分析，结果发现其开放阅读框架

全文目录


中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
第一章 文献综述  12-31
  1.猪SLA的研究概况及Ⅰ类基因最新命名进展  12-18
    1.1 SLA概述  12-13
    1.2 猪SLA Ⅰ类基因最新命名进展  13-18
  2.DM基因的研究进展  18-22
    2.1 DM基因的发现  18-19
    2.2 DM基因的结构和表达  19-20
    2.3 DM分子及其功能  20-21
    2.4 DM基因的遗传多态性及疾病关联研究  21-22
  3.LMPs基因的研究进展  22-26
    3.1 LMPs基因的发现、结构及表达  23-24
    3.2 LMPs分子在抗原递呈中的功能  24-25
    3.3 LMPs基因的多态性与疾病  25-26
  4.生物信息学虚拟试验在新基因研究的应用  26-29
    4.1 EST电子克隆  26-27
    4.2 电子表达研究  27-28
    4.3 基因的电子定位  28-29
    4.4 蛋白结构及功能预测  29
    4.5 小结  29
  5.本试验研究的目的和意义  29-31
第二章 SLA-DMB基因的克隆及分析  31-53
  1.材料  31-32
    1.1 试验动物  31
    1.2 载体与菌株  31
    1.3 网络资源及应用软件  31
    1.4 主要试剂及试剂盒  31
    1.5 主要仪器  31-32
    1.6 所用溶液及其配制  32
  2.试验方法  32-39
    2.1 SLA-DMB新基因的克隆  32-37
    2.2 测序及序列生物信息学分析  37-39
  3.结果与分析  39-50
    3.1 DMB新基因的克隆  39-41
    3.2 测序及序列生物信息学分析  41-50
  4.讨论  50-52
    4.1 SLA-DMB基因的电子延伸  50
    4.2 引物设计  50-51
    4.3 克隆测序  51-52
  5.小结  52-53
第三章 SSCP分型的方法学探讨及DM类基因的多态性研究  53-70
  1.材料和仪器  53-55
    1.1 试验材料  53-54
    1.2 菌株和载体  54
    1.3 主要药品及酶  54
    1.4 主要仪器设备  54
    1.5 溶液试剂配制  54-55
  2.试验方法  55-61
    2.1 基因组DNA的提取与纯化  55
    2.2 DNA池构建  55-56
    2.3 SLA-DMA基因第3外显子扩增  56
    2.4 DM类基因其他外显子区域扩增  56-57
    2.5 克隆测序  57-58
    2.6 菌落不对称PCR  58
    2.7 单链构象多态性方法  58-59
    2.8 DNA序列的同源比对及二级结构计算机预测分析  59
    2.9 DM类基因的群体遗传学研究  59-61
  3.试验结果与分析  61-66
    3.1 SSCP分型探讨结果与分析  61-63
    3.2 DM类基因其他外显子多态研究结果与分析  63-65
    3.3 DMA第3外显子群体遗传学研究  65-66
  4.讨论与结论  66-69
    4.1 SSCP复杂带型原因  66-67
    4.2 SSCP复杂带型图谱判型方法  67-68
    4.3 DNA池直接测序法在多态性扫描中的应用  68
    4.4 SLA-DM类功能外显子的多态性  68-69
  5.小结  69-70
第四章 猪LMP2基因的克隆、原核表达及分析  70-89
  1.材料及试剂  70
    1.1 组织样品  70
    1.2 载体菌株  70
    1.3 SDS-PAGE试剂配制  70
  2.试验方法  70-75
    2.1 猪LMP2新基因的克隆  72
    2.2 猪LMP2原核表达载体构建及表达  72-74
    2.3 猪LMP2基因部分外显子遗传变异研究  74-75
  3.结果与分析  75-86
    3.1 LMP2新基因的克隆  75-76
    3.2 测序及序列生物信息学分析  76-83
    3.3 猪LMP2原核表达载体构建及表达  83-85
    3.4 猪LMP2基因部分外显子遗传变异研究  85-86
  4.讨论  86-88
    4.1 新功能基因发现后的初步研究策略  86-87
    4.2 LMP2的原核表达及多态性分析  87-88
  5.小结  88-89
参考文献  89-95
致谢  95-96
附录  96-98
简历  98

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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