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绵羊高繁殖力候选基因INHBA和INHBB基因的研究

作　者: 庄海滨
导　师: 李学伟；储明星
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 绵羊 高繁殖力 INHBA基因 INHBB基因 PCR-SSCP
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 113次
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内容摘要


抑制素(inhibin,INH)是一种由性腺分泌的二聚体糖蛋白，由α亚基和两种β亚基(β_A、β_B)中的一个以二硫键相连形成的二聚体，它能有效抑制垂体促卵泡素的合成与分泌。本研究分析了抑制素基因β_A基因(INHBA)与抑制素基因β_B基因(INHBB)的多态性，探索这两个基因与小尾寒羊高繁殖力之间的关系，为我国开展小尾寒羊高繁殖力的遗传学基础研究提供科学依据。 本研究根据牛抑制素β_A亚基(inhibin β_A，INHBA)基因外显子1和外显子2序列设计7对引物，采用PCR-SSCP技术检测INHBA基因在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊、湖羊)以及低繁殖力绵羊品种(多赛特羊、特克塞尔羊、德国肉用美利奴羊)中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果发现INHBA1-2、INHBA2-2与INHBA2-4扩增片段有多态性，INHBA1-3、INHBA2-3扩增片段均不存在多态性，INHBA1-1、INHBA2-1两对引物扩增效果不好。对于引物INHBA1-2，经χ~2适合性检验，在小尾寒羊、特克塞尔羊中保持了Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，在湖羊中已经显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)，德国肉用美利奴羊极显著地偏离了Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)，多赛特羊没有多态，BB型和AA型相比在该片段发生1处碱基突变(C→A)，该突变没有导致氨基酸的改变，BB型小尾寒羊平均产羔数比AA型小尾寒羊多0.26只。 对于引物INHBA2-2，经χ~2适合性检验，在德国肉用美利奴羊群体中的分布都极显著地偏离了Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)，在多赛特羊中都保持了Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05)：小尾寒羊、湖羊、特克塞尔羊中没有多态。HH型和GG型相比在该片段第142位发生1处碱基突变(C→T)，该突变导致了氨基酸由丝氨酸改变为亮氨酸，高繁殖力的小尾寒羊、湖羊和低繁殖力的特克塞尔羊只出现GG基因型，而低繁殖力的多赛特羊、德国肉用美利奴羊则出现GG、GH、HH3种基因型。 对于引物INHBA2-4，经χ~2适合性检验，在小尾寒羊、湖羊、特克塞尔羊中都保持了Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，而在多赛特羊和德国肉用美利奴羊群体中极显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。LL型和KK型相比在该片段第95位发生1处碱基突变(G→A)，该突变没有导致氨基酸的改变，LL型小尾寒羊平均产羔数比KK型小尾寒羊多0.28只。 本研究根据牛抑制素β_B(inhibin β_B，INHBB)基因外显子1和外显子2序列设计6对引物，采用PCR-SSCP技术检测INHBB基因外显子1和外显子2在5个绵羊品种中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊和湖羊高繁殖力的影响。结果表明：只有外显子2的第3对引物NHBB2-3扩增片段具有多态性，INHBB2-2扩增片段都没有多态性，其余有4对引物扩增效果不好。对于引物INHBB2-3，只在高繁殖力的湖羊中发现3种基因型(AA、AB、BB)，而其余4种绵羊都只有AA基因型；统计结果表明：湖羊AA、AB、BB基因型频率分别为0.636、0.046、0.318：经经χ~2适合性检验，适合性检验，在湖羊中保持了Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)：测序结果

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章 文献综述  13-26
  1 绵羊高繁殖力机制研究进展  13-17
    1.1 多胎绵羊品种  13
    1.2 绵羊多胎的生殖生理  13
    1.3 绵羊遗传机制探索  13-15
      1.3.1 绵羊多胎主基因的发现  13-14
      1.3.2 绵羊多胎主基因的作用及其机理  14
      1.3.3 绵羊多胎主基因遗传标记的研究  14-15
    1.4 小尾寒羊的研究概况  15-17
      1.4.1 品种数量  15
      1.4.2 外貌特征  15-16
      1.4.3 繁殖性能  16
        1.4.3.1 性成熟早  16
        1.4.3.2 发情与妊娠  16
        1.4.3.3 非季节性繁殖  16
        1.4.3.4 产羔数  16
      1.4.4 适应性  16-17
    1.5 开展绵羊高繁殖力机制研究的意义与前景  17
  2 抑制素的研究进展  17-22
    2.1 抑制素基因克隆及基因结构特征  17-18
    2.2 抑制素基因定位及多态性分析  18-19
    2.3 抑制素基因的表达  19-20
    2.4 抑制素基因表达的分子调节  20
    2.5 抑制素基因与哺乳动物繁殖性能的关系  20-22
    2.6 抑制素基因的研究意义  22
  3 Touchdown PCR  22
  4 PCR-SSCP技术在畜禽育种中的应用  22-25
    4.1 PCR-SSCP的建立与发展  23
    4.2 PCR-SSCP方法的原理  23
    4.3 PCR-SSCP的特点  23-24
    4.4 PCR-SSCP方法的应用  24-25
  5 本研究的目的和意义  25-26
第二章 绵羊INHBA基因与INHBB基因多态性检测及序列分析  26-52
  1 材料和方法  26-29
    1.1 试验材料  26
    1.2 菌株和载体  26
    1.3 药品和酶  26
    1.4 主要仪器设备  26-27
    1.5 溶液试剂配制  27-29
  2 主要实验步骤  29-39
    2.1 羊血液DNA的提取  29-30
    2.2 DNA浓度和纯度的检测  30
    2.3 PCR-SSCP过程  30-35
      2.3.1 INHBA基因引物设计和PCR扩增  30-32
      2.3.2 INHBB基因引物设计和PCR扩增  32-33
      2.3.3 PCR结果的琼脂糖凝胶电泳检测  33-34
      2.3.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  34-35
        2.3.4.1 凝胶制备及电泳  34
        2.3.4.2 硝酸银染色方法  34-35
        2.3.4.3 INHBA基因SSCP分析条件  35
        2.3.4.4 INHBB基因SSCP分析条件  35
    2.4 绵羊INHBA与INHBB基因部分序列克隆和测序  35-39
      2.4.1 目的片段的回收  35-36
      2.4.2 连接反应  36
      2.4.3 感受态细胞的制备—氯化钙法  36-37
      2.4.4 转化  37-38
      2.4.5 质粒DNA的小规模提取—碱裂解法  38
      2.4.6 重组质粒的鉴定  38-39
  3 统计分析方法  39-41
    3.1 基因频率  39
    3.2 基因型频率  39
    3.3 群体杂合度  39-40
    3.4 多态信息含量  40
    3.5 基因位点Hardy-Weinberg平衡状态的检验  40-41
    3.6 基因多态性与绵羊产羔数的相关分析  41
  4 SSCP检测结果基因型命名  41-45
    4.1 PCR-SSCP多态性检测结果  41-43
      4.1.1 INHBA基因PCR-SSCP的结果  41-43
      4.1.2 INHBB基因PCR-SSCP的结果  43
    4.2 克隆与测序结果  43-45
      4.2.1 INHBA基因扩增片段测序结果  43-45
      4.2.2 INHBB基因扩增片段测序结果  45
  5 突变位点的群体遗传学研究结果  45-52
    5.1 INHBA基因突变位点的群体遗传学研究结果  45-48
      5.1.1 基因频率和基因型频率分析  45-46
      5.1.2 遗传特性分析  46-47
      5.1.3 Hardy-Weinberg平衡的检验  47-48
    5.2 INHBB基因突变位点的群体遗传学研究结果  48-50
      5.2.1 基因频率和基因型频率分析  48-49
      5.2.2 遗传特性分析  49
      5.2.3 Hardy-Weinberg平衡的检验  49-50
    5.3 INHBA与INHBB基因多态性与小尾寒羊高繁殖力性状的相关分析  50-52
      5.3.1 INHBA基因多态性与小尾寒羊高繁殖力性状的相关分析  50
      5.3.2 INHBB基因多态性与小尾寒羊高繁殖力性状的相关分析  50-52
第三章 讨论与结论  52-61
  1 实验材料的选择  52
  2 影响PCR扩增反应的因素  52-53
    2.1 模板的质量  52
    2.2 引物的设计  52-53
    2.3 引物的浓度  53
    2.4 PCR反应的温度  53
    2.5 镁离子的浓度  53
  3 影响SSCP检测的因素  53-56
    3.1 PCR产物的质量  54
    3.2 DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响  54
    3.3 PCR片段的长度  54
    3.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶成分  54-55
    3.5 上样缓冲液与变性  55
    3.6 电泳条件  55
    3.7 其它因素  55-56
  4 SSCP结果的分析  56
  5 INHBA与INHBB基因测序结果分析  56-57
    5.1 INHBA基因测序结果分析  56-57
    5.2 INHBB基因测序结果分析  57
  6 INHBA与INHBB基因群体遗传特性的分析  57-58
    6.1 INHBA基因群体遗传特性的分析  57-58
    6.2 INHBB基因群体遗传特性的分析  58
  7 SSCP检测结果对绵羊产羔数影响的分析  58-59
    7.1 INHBA基因多态性与绵羊产羔数的相关分析  58-59
    7.2 INHBB基因多态性与绵羊产羔数的相关分析  59
  8 结论  59-61
参考文献  61-67
致谢  67-68
攻读学位期间发表的论文  68

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 羊
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