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AP-1圈套寡核苷酸抑制NIH3T3细胞胶原表达的实验研究

作　者: 郝天智
导　师: 梁华平；吕凤林
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 核转录因子圈套寡核甘酸 AP-1 α2Ⅰ型胶原基因治疗
分类号: R602
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

增生性瘢痕及瘢痕疙瘩又称病理性瘢痕，是创面过度修复的结果，不仅影响美观，而且常常伴有刺痛、瘙痒等症状以及肢体的运动、功能障碍，严重影响患者的生活质量及身心健康。目前用于治疗病理性瘢痕的方法很多，但治疗效果均不理想。其疗效差的主要原因在于对病理性瘢痕的发病机制认识不足，尚未找到治疗病理性瘢痕的关键环节。与普通瘢痕相比，病理性瘢痕的组织学特征表现在细胞外有大量基质沉积，其主要成分为Ⅰ型胶原（包括α₁Ⅰ及α₂Ⅰ两种亚型）。已证明，多种细胞与多种细胞因子的相互作用是细胞外基质沉积的主要原因。进一步研究发现，无论是细胞因子、细胞外基质，还是细胞间的直接接触作用，均需通过细胞膜及相应的受体启动成纤维细胞的信号转导途径，最终导致Ⅰ型胶原等基质基因的转录表达。核转录因子活化蛋白-1（Activatorprotein，AP-1）正处于以上诸因素启动Ⅰ型胶原基因表达的核心环节。并且AP-1的活化可使金属蛋白酶组织抑制物（Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP）的合成增加，从而特异性地抑制组织中具有降解胶原功能的基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）的活性，进而减少胶原的降解。所以，本研究提出假设，抑制AP-1的活性，既可以抑制Ⅰ型胶原的合成，又可以促进胶原的降解，从而达到治疗病理性瘢痕的目的。核转录因子圈套策略（transcription factor decoy strategy,TFDS）是近年来发明的基因治疗方法之一，该方法人工合成双链寡核苷酸片段（oligodeoxynucleotides，ODNs）其中含有与核转录因子作用的顺式元件（cis-element）中的核心序列一致的序列，将该ODNs导入细胞后，可以和DNA一道竞争性地与核转录因子结合，从而发挥竞争抑制相应核转录因子的功能，最终达到基因治疗的目的。基于上述设想，本课题设计合成了靶向AP1的DecoyODNs及无关序歹 ODNs，用凝胶迁移变动分析（electrophoretic mobility sh五 assay，EMSA）检验合成的DecoyODNs是否可以竟争性的抑制API的活性。然后，用阳离子脂质体包裹荧光标记的Deco少ODNs转染鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞，观察其在细胞中的分布及变化规律；最后采用逆转录聚合链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR）及酶联兔疫吸附试验（enzyme－linked lmmunoadsordent assays ELISA）从基因水平及蛋白水平研究 Decoy－ODNs对 NIH3T3 细胞a if型胶原表达的调节，探讨AP1 对病理性瘫痕进行基因治疗的可行性。结果表明，DecoyODNs在细胞外可以竞争性地抑制AP上的活性，且抑制效果强于相同浓度的冷探针，无关序列完全无效。用阳离子脂质体转染荧光标记的DecoyODNs，半小时细胞内即有少量荧光，1小时显微镜下可见所有的细胞内均有荧光信号。随着时间的延长，细胞内荧光强度逐渐增强；荧光信号开始主要分布于胞浆，然后逐渐进入细胞核，并有细胞核内浓集的现象。RT－PCR及ELISA的实验分别在基因水平及蛋白水平证实，设计合成的 DecoyODNs可以抑制 a if型胶原的合成。通过本研究，我们得出以下结论： 1．DecoyODNs在体外可以桔抗APl的活性，且这种抑制作用呈浓度依赖性。 2阳离子脂质体可以有效地将DecoyODNs转染入细胞浆及细胞核。 3·DecoyODNs可以明显抑走 a ZI型胶原的合成。 4．无关序列的ODNS无明显的抑制作用。 5．靶向AP的DecoyODNs用于病理性疲痕的基因治疗有一定的可行性。本研究为病理性癫痕的临床基因治疗研究奠定了一定的理论基础，并提供了一定的技术手段。

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英文缩写中英文对照表  3-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-11
论文正文 AP-1圈套寡核苷酸抑制NIH3T3细胞胶原表达的实验研究  11-48
  前言  11-12
  材料与方法  12-23
  实验结果  23-27
  讨论  27-32
  结论  32-33
  致谢  33-34
  照片  34-41
  参考文献  41-48
文献综述一瘢痕疙瘩及增生性瘢痕研究进展  48-61
  参考文献  56-61
文献综述二 NF-κB拮抗措施的研究进展  61-70
  参考文献  67-70
硕士期间撰写和发表的文章  70

AP-1圈套寡核苷酸抑制NIH3T3细胞胶原表达的实验研究

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