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慢性粒细胞白血病cyclin D2 的表达研究

作　者: 宋俊敏
导　师: 徐世荣
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 细胞周期素D2 慢性粒细胞白血病 p210BCR/AB 酪氨酸激酶胞内抗体流式细胞术
分类号: R733.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

目的：细胞周期素D2(cyclin D2)是人类G1期细胞周期蛋白cyclin D家族的一个重要成员，与正常细胞周期进展中G1／S检测调控点的功能密切相关。cyclin D2的表达与成人T淋巴细胞白血病病毒(HTLVⅠ)原癌基因产物Tax以及与各型B淋巴细胞白血病、成人生殖细胞肿瘤的相关性已被证实。慢性粒细胞白血病是一种原发于造血干祖细胞的恶性克隆性疾病。其中，BCR／ABL融合基因产物蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性异常增高，导致底物信号分子磷酸化，在BCR／ABL恶性转化过程中起着极为重要的作用。本研究是建立在赵春华教授在国际上首次建立的表达b3a2 BCR／ABL cDNA的人慢性粒细胞白血病原代造血干祖细胞模型以及表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内单克隆抗体MSCV-ib-IRES-eGFP逆转录病毒载体的工作基础上。我们进一步将此逆转录病毒载体转导人BCR／ABL+的K562慢性髓系白血病细胞系，建立了表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶胞内单克隆抗体的K562-ib-eGFP体外细胞模型，并以这两种模型为基础研究了cyclin D2在慢性粒细胞白血病中的表达及其与BCR／ABL融合基因产物蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性之间的关系。方法：以半定量逆转录-聚合酶链(RT-PCR)法检测cyclin D2 mRNA在人慢性粒细胞白血病原代造血干祖细中文摘要胞模型以及对照模型中的表达。以碱裂解法大量扩增表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内单克隆抗体的逆转录病毒载体MSCV－fo－IRES七GFP 以及对照载体MSCV－IRES七GFP。采用聚己二醇沉淀法纯化提取的质粒。采用 PCL－AmphO质粒快速转染系统，共转染 293hi包装细胞系，将获得的病毒上清转导K562细胞系，建立了表达抗ABL 蛋白酪氨酸激酶胞内单克隆抗体的K562－fo七GFP细胞模型。同时，采取同样方法建立对照模型K562七GFP。通过合成胞内抗体特异性引物，以PCR的方法，检测胞内抗ABL蛋白单克隆抗体的表达。以免疫印迹法检狈K562，K562－ibeGFP及K562－eGFP细胞中BCR朋L及C－ABL蛋白的表达，以PTK特异性底物l；lL．SRC法检测抗体模型中BCRABL及0ABL蛋白酪氨酸激酶活性的变化。以半定量逆转录－聚合酶链（RTPCR）法检狈K562细胞、K562－ibeGFP细胞、K562－eGFP细胞以及 15例 CML患者骨髓细胞、12例正常人骨髓标本中cyclin DZ IlllLrvA的表达。以免疫印迹法检测 K562细胞。K562一七GFP细胞、K562《GFP细胞 cyclin DZ蛋白质表达。以流式细胞术间接免疫荧光标记法检测上述标本cyclin DZ蛋白质水平的变化。应用FACS calibur流式细胞仪，cellquest软件，分析K562细胞、K562－ibeGFP细胞以及K562《GFP细胞周期分布以及 cyclin DZ细胞周期时相性表达。结果：以RT干CR法，在人CML原代造血于祖细胞模型中能检测到 cyclin DZ基因的表达，在转染空载体MSCV七GFP 的脐血CD34＋七GFP 细胞以及脐血 2 中文摘要 CD34”七GFP细胞中，末能检测到 cyclin DZ基因表达。在表达抗ABL 蛋自酪氨酸激酶胞内抗体的 K562．fo七GFP细胞模型中，用PCR的方法，能够检测到胞内单克隆抗体的表达。通过免疫印迹法检测 KS 62－fo七GFP抗体模型中BCRABL及c－ABL蛋白的表达，我们发现，表达抗人ABL酪氨酸激酶区胞内单克隆抗体的K562－ibeGFP细胞与K562细胞以及K562干GFP 细胞相比，其 pZIO队…‘及 ABL蛋白的表达仅轻度降低。然而，以PTK特异性底物RRSRC法检测抗体模型中BCRABL及C－ABL蛋白酪氨酸激酶活性，我们发现，免疫沉淀的BCR／ABL及0ABL 蛋白P皿活性在 KS 62．fo卡GFP 细胞为24％M％，K562 细胞为 100％士13％，K562．eGFP细胞为 96ti2 ％。K562．ibeGFP 细胞与K562细胞相比，其活性下降了76％，两者具有明显统计学差异（P＜0．05人K562七诽P细胞与K562细胞相比，无明显统计学差异（P＞0刀5人细胞总蛋白P皿活性，K562－fo－eGFP细胞为52％士7％，K562细胞为 100％土19％，K562－eGFP细胞为 95％士17％。K562－fo．eGFP 细胞与＊562细胞相比，具有明显统计学差异O＜0刀5人 K562七GFP细胞与K562细胞相比，无明显统计学差异（P＞（刀5）。在 K562、K562．eGFP细胞中，以 RTPCR 法能够检测到 CyClin DZ基因的表达，而在表达抗人 ABL 酪氨酸激酶区胞内单克隆抗体的K562一卜eGFP细胞中， CyClin DZ基因表达明显受抑。采用免疫印迹法，我们进一步证实了K562－ibeGFP细胞CyClin DZ蛋白质水平的下调。以RTPCR法以及流式细胞术间接免疫荧光标记 3 中文摘要法检测 15例 CML患者骨髓标本以及 12例对照的 CyClinDZ MA及蛋白质表达

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