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小鼠多能成体祖细胞的培养及冷冻保存
作 者: 王原媛
导 师: 黄勋彬
学 校: 华中科技大学
专 业: 妇产科学
关键词: 骨髓细胞 原代培养 接种密度 MTT Giemsa MACS 细胞分选 台盼蓝 流式细胞术 鉴定 冻存
分类号: R329
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
第一部分BALB/c小鼠多能成体祖细胞的分离培养目的建立获得大量BALB/c小鼠多能成体祖细胞(MAPC)的细胞分离和原代培养方法,为下一步获得纯化的MAPC奠定基础。方法从BALB/c小鼠胫骨和股骨中分离得到骨髓细胞悬液,采用全骨髓差异贴壁法,在含EGF、PDGF、LIF和低血清的培养基中培养,2周后以一定比例传代,继续培养,将不同时期细胞进行Giemsa染色,观察细胞形态,通过MTT比色法比较不同周龄小鼠、原代接种密度和传代接种密度对原代MAPC生长的影响。结果取材自3周小鼠所获得原代细胞均一性和增殖情况最好,原代接种密度在(6~12)×10~5/cm~2,传代接种密度在(20-30)×10~3/cm~2最有利于原代MAPC的生长。Giemsa染色可见梭形和三角形细胞。结论在本实验条件下,BALB/c小鼠的原代MAPC能较稳定生长和扩增,给后续MACS分选提供了大量的细胞来源。第二部分BALB/c小鼠多能成体祖细胞的纯化和扩增目的获得纯化的MAPC并探索MAPC体外稳定传代扩增的培养条件,建立MAPC细胞系,为探索MAPC向生殖细胞的诱导分化潜能打下基础。方法取传2代的骨髓细胞,磁珠阴性分选去除CD45+和Ter119+细胞,将所获目的细胞以一定密度接种,观察细胞生长情况,并绘制MAPC生长曲线。台盼蓝检测MACS分选前后细胞活力有无差异,MTT比色法比较不同接种密度对MAPC生长的影响。结果MACS分选前后细胞活性无显著性差异(P﹥0.05),MAPC的最适接种密度为(6-10)×10~3/cm~2,MAPC接种后1-2天处于生长停滞期,第3天进入对数增长期,约持续3天,以后进入平台期。分选后MAPC核大,胞质少,呈梭形或三角形。结论MACS阴性分选能获得相对单一并具有良好增殖活性的MAPC。第三部分BALB/c小鼠多能成体祖细胞的鉴定和冷冻保存目的鉴定本实验培养的MAPC,并对MAPC的冷冻保存方法的效果进行了评价,为诱导分化实验提供足够的细胞来源。方法流式细胞术检测MAPC表面标记CD 13、CD44和CD34的表达情况。采用文献报道的方法对MAPC进行冷冻保存,对温度稍作调整,比较冻存前后细胞活力。结果MAPC表面CD13~+、CD44~-和CD34~-。细胞冻存前后活力无显著性差异(P﹥0.05)。结论全骨髓贴壁结合磁性分选是获得MAPC的有效方法,采用文献报道的冷冻方法能较好的保存MAPC,保持其生长活性。
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全文目录
缩略语表 5-6 中文摘要 6-8 Abstract 8-11 引言 11-16 参考文献 14-16 第一部分 BALB/c 小鼠多能成体祖细胞的分离培养 16-30 前言 16 材料与方法 16-20 结果 20-24 讨论 24-26 图片 26-30 第二部分 BALB/c 小鼠多能成体祖细胞的纯化和扩增 30-40 前言 30 材料与方法 30-33 结果 33-35 讨论 35-37 图片 37-40 第三部分 BALB/c 小鼠多能成体祖细胞的鉴定和冷冻保存 40-46 前言 40 材料与方法 40-42 结果 42-43 讨论 43-46 全文小结 46-47 参考文献 47-48 综述 48-61 参考文献 56-61 致谢 61
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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