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酵母及重组大肠杆菌不对称合成（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

作　者: 蒋晓霞
导　师: 林建平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学工程
关键词: 不对称还原 4-氯乙酰乙酸乙酯 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 木兰假丝酵母 生物催化 E coli M15(pQE30-car)
分类号: TQ225.24
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)是一种重要的手性药物中间体,可用于合成HGM-CoA还原酶抑制剂和β-1,4-二氢吡啶类钙离子通道阻断剂等药物,具有重要的应用价值。 首先,从实验室保藏的七株酵母菌株中筛选出具有较高还原能力和手性选择性的菌株——木兰假丝酵母(Candida magnoliae)。优化其还原反应条件,结果表明,25g/L木兰假丝酵母在30℃,以10g/L的葡萄糖为辅助底物的缓冲溶液(pH6.0)中能将12.1g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)还原为(S)-CHBE,此时产物得率为87.5%,对映体过量值(e.e.值)为76.4%。当细胞量增至45g/L时产物得率和e.e.值分别提高至99.2%和85.2%。提高底物浓度后,发现单相反应过程存在比较严重的底物及产物抑制。底物分批加入可以部分解除底物抑制,但产物抑制作用仍然存在。 为减轻产物抑制的影响,研究Candida magnoliae两相体系中不对称还原反应,并优化其还原反应条件。结果表明,在水/乙酸丁酯两相体系中,30℃时在添加50g/L葡萄糖的缓冲溶液中,100g/L的木兰假丝酵母可在滴加底物条件下将60.5g/L的COBE还原为(S)-CHBE,产物得率为93.8%,e.e.值为85.7%。 此外,还研究了经热处理的木兰假丝酵母催化COBE立体选择性还原反应。新鲜木兰假丝酵母菌株经热处理(55℃、30min)后具有高度的立体选择性,且不受还原条件的影响,产物为(S)型,e.e.值大于99%。且此过程中不需添加任何商业辅酶NADP~+/NADPH及葡萄糖脱氢酶(GDH)。在水/乙酸丁酯两相体系中,经55℃加热30min处理后的Candida magnoliae(100g/L),可将60.5g/L的COBE还原为(S)-CHBE,产物得率为58.5%,其e.e.值大于99%。 最后,构建了具有较高羰基还原酶酶活的大肠杆菌菌株E.coli M15(pQE30-car)和较高葡萄糖脱氢酶酶活的大肠杆菌菌株E.coli M15(pQE30-gdh0310)。优化其培养条件和不对称还原反应条件,30℃时50g/L的E.coli M15(pQE30-car)和50g/L的E.coli M15(pQE30-gdh0310)在100mM,pH6.0的磷酸盐缓冲液中能将12.1g/L的COBE还原为(S)-CHBE,其产物得率为78.4%,其e.e.值大于99%。在水/乙酸丁酯两相体系中,100 g/L的E.coli M15(pQE30-car)和100 g/L的E.coli M15(pQE30-gdh0310),在pH6.0的磷酸盐缓冲液中(50g/L的葡萄糖)振荡反应(100 r/min)时,可将60.5g/L的COBE转化为(S)-CHBE,产物得率为42.0%,其e.e.值大于99%。

全文目录


目录  3-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
第一章 文献综述  9-26
  1．1 引言  9
  1．2 手性化合物的研究意义  9-12
  1．3 获得手性化合物的主要方法  12-17
    1．3．1．物理法  12-13
      1．3．1．1 手性溶剂拆分法  12
      1．3．1．2 接种结晶拆分法  12-13
    1．3．2 化学法  13-14
      1．3．2．1 经典成盐拆分法  13
      1．3．2．2 组合拆分  13
      1．3．2．3．萃取拆分法  13-14
    1．3．3 生物法  14-15
      1．3．3．1 微生物法  15
      1．3．3．2 酶法  15
    1．3．4 色谱法  15-16
      1．3．4．1 气相色谱法  16
      1．3．4．2 高效液相色谱法  16
      1．3．4．3 模拟移动床色谱法  16
    1．3．5．膜法  16-17
      1．3．5．1 液体膜拆分  16-17
      1．3．5．2 手性固定膜拆分  17
  1．4 微生物制备手性化合物的特点及优势  17-18
  1．5 微生物全细胞生物不对称合成4-氯-3-羟基丁酸乙酯  18-24
    1．5．1 微生物全细胞生物不对称合成4-氯-3-羟基丁酸乙酯的原理  18-19
    1．5．2 影响微生物全细胞生物不对称合成的因素  19-24
      1．5．2．1 微生物种类  19
      1．5．2．2 微生物细胞的形式  19-22
      1．5．2．3 微生物细胞的培养条件  22
      1．5．2．4 辅助底物及辅酶再生  22
      1．5．2．5 酶的激活剂或抑制剂  22-23
      1．5．2．6 反应体系  23-24
      1．5．2．7 底物浓度及添加方式  24
  1．6 拟研究的内容和方向  24-26
第二章 材料与方法  26-33
  2．1 实验材料  26-28
    2．1．1 质粒与菌种  26-27
      2．1．1．1 酵母菌株及培养基  26
      2．1．1．2 酵母菌株培养方法  26
      2．1．1．3 大肠杆菌菌种质粒及培养基  26
      2．1．1．4 试剂  26-27
    2．1．2 工具酶和试剂盒  27
    2．1．3 主要仪器  27-28
  2．2 实验及分析方法  28-33
    2．2．1 分子克隆相关实验  28
    2．2．2 菌体浓度的测定  28
    2．2．3 产物得率及e．e．值分析方法  28-29
    2．2．4 细胞超声波破碎及胞内蛋白的提取  29
    2．2．5 蛋白浓度的测定  29-30
    2．2．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  30-31
    2．2．7 羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶酶活测定  31
    2．2．8 还原糖的测定方法  31-33
第三章 微生物菌种的筛选及不对称合成(S)-CHBE  33-45
  3．1 引言  33
  3．2 材料与方法  33
    3．2．1 材料与试剂  33
      3．2．1．1 菌种、培养基与培养方法  33
      3．2．1．2 试剂  33
    3．2．2 方法  33
      3．2．2．1 还原方法  33
      3．3．2．2 分析方法  33
  3．3 结果和讨论  33-44
    3．3．1 菌种的筛选  33-34
    3．3．2 木兰假丝酵母生长时间对产物得率及e．e．值的影响  34-36
    3．3．3 木兰假丝酵母保存时间对产物得率及e．e．值的影响  36
    3．3．4 培养条件及反应条件对产物得率及e．e．值的影响  36-37
    3．3．5 辅助底物及其添加量对产物得率及e．e．值的影响  37-40
    3．3．6 转化时间对产物得率及e．e值的影响  40
    3．3．7 温度对产物得率及e．e．值的影响  40-41
    3．3．8 pH值对产物得率及ee值的影响  41-42
    3．3．9 底物的加入量对产物得率及e．e．值的影响  42
    3．3．10 底物分批加入与一次性加入对产物得率及e．e．值的影响  42-43
    3．3．11 细胞量对产物得率及e．e．值的影响  43
    3．3．12 烯丙醇对产物得率及e．e．值的影响  43-44
  3．4 小结  44-45
第四章 两相体系中木兰假丝酵母不对称还原制备(S)-CHBE  45-53
  4．1 引言  45-46
  4．2 材料与方法  46
    4．2．1 材料  46
      4．2．1．1 试剂  46
      4．2．1．2 菌种  46
      4．2．1．3 培养基  46
    4．2．2 方法  46
      4．2．2．1 菌体培养方法  46
      4．2．2．2 还原方法  46
  4．3 结果与讨论  46-52
    4．3．1 单相和水／乙酸丁酯两相体系的比较  46-47
    4．3．2 有机溶剂对木兰假丝酵母不对称还原的影响  47-48
    4．3．3 水相与有机溶剂相体积比对产物得率及e．e．值的影响  48
    4．3．4 转速对产物得率及e．e．值的影响  48-49
    4．3．5 葡萄糖浓度对产物得率及e．e．值的影响  49
    4．3．6 细胞量对产物得率及e．e．值的影响  49-50
    4．3．7 温度对产物得率及e．e．值的影响  50-51
    4．3．8 底物加入方式对产物得率及e．e．值的影响  51-52
  4．4 小结  52-53
第五章 热处理木兰假丝酵母制备光学纯(S)-CHBE  53-62
  5．1 引言  53
  5．2 材料与方法  53-54
    5．2．1 材料  53
      5．2．1．1 试剂  53
      5．2．1．2 菌种  53
      5．2．1．3 培养基  53
    5．2．2 方法  53-54
      5．2．2．1 菌体培养方法  53
      5．2．2．2 丙酮干细胞及空气干细胞的制备  53
      5．2．2．3 还原方法  53-54
  5．3 结果和讨论  54-60
    5．3．1 加热对产物得率及e．e．值的影响  54-55
    5．3．2 反应前加热温度对产物得率及e．e．值的影响  55-56
    5．3．3 加热时间对产物得率及e．e．值的影响  56
    5．3．4 底物浓度对产物得率及e．e．值的影响  56-57
    5．3．5 葡萄糖浓度对产物得率及e．e．值的影响  57
    5．3．6 还原反应温度对产物得率及e．e．值的影响  57-59
    5．3．7 细胞量对产物得率及e．e．值的影响  59
    5．3．8 两相体系中的还原反应  59-60
  5．4 小结  60-62
第六章 重组大肠杆菌的构建及不对称还原制备(S)-CHBE  62-77
  6．1 引言  62
  6．2 材料和方法  62-67
    6．2．1 菌种、质粒、培养基与培养方法  62-63
    6．2．2 工具酶和试剂盒  63
    6．2．3 引物  63
    6．2．4 羰基还原酶DNA的获得与PCR扩增  63
    6．2．5 克隆载体的构建  63-64
    6．2．6 表达载体的构建及酶切鉴定  64-66
    6．2．7 E. coli M15(pQE30-gdh0310)的构建  66
    6．2．8 酶活测定  66
    6．2．9 还原方法  66-67
  6．3 结果与讨论  67-75
    6．3．1 培养基的选择  67
    6．3．2 培养温度  67-68
    6．3．3 诱导条件  68-70
      6．3．3．1 诱导温度  68-69
      6．3．3．2 诱导剂IPTG的加入量  69
      6．3．3．3 诱导后的发酵时间  69-70
    6．3．4 各种菌株中酶活的比较  70
    6．3．5 E. coliM15(pQE30-car)不对称还原COBE  70-71
    6．3．6 底物浓度对单菌转化及混菌转化产物得率的影响  71-72
    6．3．7 E coliM15(pQE30-car)及E. coliM15(pQE30-gdh0310)质量比对产物得率的影响  72-73
    6．3．8 温度对产物得率的影响  73
    6．3．9 单菌培养及混菌培养时NADPH的浓度的变化  73-74
    6．3．10 两相体系中的还原反应  74-75
  6．4 小结  75-77
第七章 结论  77-79
参考文献  79-85
致谢  85

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