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水相中酵母细胞催化前手性羰基不对称还原合成手性醇的研究

作　者: 杨忠华
导　师: 姚善泾
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 不对称还原 手性合成 手性醇 酵母 生物还原 4-氯乙酰乙酸乙酯 S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 苯乙酮 S-a-苯乙醇 2-辛酮 S-2-辛醇
分类号: TQ920
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


手性医药、农药以及其它精细化学品,在日常生活和工农业生产中的重要作用越来越受到人们的重视。因而合成这些手性产品的关键手性砌块也成了当前合成界研究的热点。生物催化因其高效和高度的立体选择性,成为手性合成最重要的方法之一。本文以4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮和2-辛酮分别为β-羰基酯、芳香酮和脂肪酮的模型底物,研究了利用活性酵母细胞催化这三类前手性酮不对称还原合成相应手性醇的反应特性。所得到的手性醇是许多手性医药和其它手性精细化学品的关键手性砌块。首先,以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为β-羰基酯的模型底物,考察了酵母细胞在水相体系中催化其不对称还原的反应特性。实验发现,酵母细胞在水相体系中能催化该底物的不对称还原,生成以S(或D)-型为主的4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE),反应活性很高,产物CHBE的得率可达到85%左右。但反应的立体选择性不是很高,S-CHBE的e.e.值最高只能达到85%左右。同时发现在水相体系中反应,存在一定程度的副反应。实验考察了底物浓度、产物的抑制、反应体系的pH、反应温度以及辅助底物等反应条件和菌体培养条件对酵母细胞不对称还原COBE的影响。发现高浓度底物和产物对反应具有抑制作用,pH7和35℃左右的反应温度有利于反应的进行,以葡萄糖作辅助底物和好氧条件下培养的菌体可以获得较好的反应结果。其次,由于酵母细胞不对称还原COBE的立体选择性达不到实际应用的要求,因此研究了利用酶抑制剂预处理酵母细胞来提高反应的立体选择性。实验发现利用烯丙基化合物和热对酵母细胞进行预处理,可以控制和提高其还原COBE的立体选择性。热和烯丙基醇预处理可以提高S-型产物的e.e.值,通过优化预处理条件可以使热、烯丙基醇预处理后S-CHBE的e.e.值分别达到97%和95%。而烯丙基溴预处理可以使反应立体选择性从通常的生成S-型产物过量转变为R-型产物过量,优化处理条件后能使R-CHBE的e.e.值达到98%。实验进一步考察了预处理对酵母粗酶液中还原COBE酶活和酵母细胞活性的影响,发现预处理控制和提高反应立体选择性的原因是预处理时抑制了胞内一部分催化COBE还原生成另一对映异构体产物的酶的活性。实验发现低强度的预处理对酵母的细胞活性影响不大。第三,活性细胞的催化过程通常具有时-空产率低的不足,这主要是反应底物的初始浓度不高造成的。为了促进活性酵母细胞催化COBE不对称还原反应的时-空产率和反应立体选择性,对利用引入树脂缓释底物和原位吸附产物来提高浙江大学博士学位论文反应底物的初始浓度和反应的立体选择性进行了研究。实验发现使用AMBERLITE⑧xADI 600大孔吸附树脂,可以显著地提高反应底物的初始浓度和反应立体选择性。引入吸附树脂后反应底物的初始浓度即使达到126 mmol几后,反应的立体选择性还可以保持在90%以上。对引入树脂的反应过程进行了分析,得出了描述整个过程的数学方程。利用实验数据对方程参数进行了拟合,发现所得到的方程能很好地模拟整个过程。 第四,为了对利用活性酵母细胞不对称还原芳香酮有所认识,本文以苯乙酮(ACP)为模型底物研究了酵母细胞催化前手性芳香酮不对称还原的反应特性。发现酵母细胞在水相体系中能催化ACP的不对称还原生成以S一型为主的a一苯乙醇(P EA),反应的立体选择性很高,S一PEA的e.e.值可达99%左右。考察了各种反应条件对反应的影响。发现反应条件对反应立体选择性影响不大,但对产物的得率有较大影响,反应体系的pH为7一8、温度30℃左右、酵母细胞用量0.2 g/mL左右能获得较好的产物得率,高浓度的底物和产物对细胞具有较高的毒性,同时发现酵母细胞能选择性地氧化S一PEA为ACP。研究了通过添加树脂来提高反应底物的初始浓度。发现杭州争光树脂厂的ZG3大孔吸附树脂可以很好地促进反应底物初始浓度的提高,使产物浓度达到12.4~o1几。 最后,以2一辛酮(2一Octanone)为模型底物研究了酵母细胞不对称还原前手性脂肪酮的反应特性。发现在水相体系中酵母细胞催化2一辛酮的不对称还原,生成以S一2一辛醇为主的产物。反应的立体选择性很高,S一型产物的e.e.值达95%以上。考察了各种反应条件对反应的影响,发现较高的底物和产物浓度对反应具有抑制作用,pH7.5、反应温度3小36℃以及以葡萄糖为辅助底物对反应较为有利。关键词:不对称还原,手性合成,手性醇,酵母,生物还原,4一氯乙酞乙酸乙酷, S一4一氯一3一经基丁酸乙醋,R一4一氯一3一轻基丁酸乙酷,苯乙酮,S一a一苯乙醇, 2一辛酮,S一2一辛醇

全文目录


第一章 绪论  16-43
  1． 1 手性技术的应用及其研究现状  16-19
    1． 1． 1 手性技术在医药中的应用及研究概况  16-18
    1． 1． 2 手性技术物在农药及其它精细化学品中的应用  18-19
  1． 2 手性化合物的制备方法  19-22
    1． 2． 1 手性源法  19-20
    1． 2． 2 拆分方法  20-21
      1． 2． 2． 1 物理拆分  20
      1． 2． 2． 2 动力学拆分  20-21
    1． 2． 3 不对称合成  21-22
      1． 2． 3． 1 化学法催化羰基的不对称还原  21
      1． 2． 3． 2 生物法催化羰基的不对称还原  21-22
  1． 3 面包酵母催化不对成合成的底物类型  22-27
    1． 3． 1 简单酮的还原  23
    1． 3． 2 β-羰基酯的还原  23-24
    1． 3． 3 α-羰基醛或酮的还原  24
    1． 3． 4 含硫官能团酮的还原  24
    1． 3． 5 β-二酮和γ-二酮的还原  24-25
    1． 3． 6 碳-碳双键的还原  25
    1． 3． 7 催化碳-碳键的形成  25-26
    1． 3． 8 芳香酮的还原  26
    1． 3． 9 酯的水解  26-27
  1． 4 反应立体选择性的控制及提高方法  27-32
    1． 4． 1 筛选合适的生物体  27-28
    1． 4． 2 改变底物的局部结构  28
    1． 4． 3 加入各种酶的抑制剂  28-29
    1． 4． 4 控制反应底物的浓度  29
    1． 4． 5 固定化菌体  29-30
    1． 4． 6 选择不同的反应溶剂  30
    1． 4． 7 控制细胞的生理条件  30-31
    1． 4． 8 对微生物进行基因工程改造  31-32
  1． 5 提高反应底物浓度及促进反应时-空产率  32-33
    1． 5． 1 以有机溶剂作反应介质提高反应底物浓度  32
    1． 5． 2 添加吸附树脂提高反应底物浓度  32-33
  1． 6 本论文主要研究思路及内容  33-34
  参考文献  34-43
第二章 酵母细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯的反应特性  43-62
  2． 1 前言  43-44
  2． 2 材料和方法  44-48
    2． 2． 1 材料  44
      2． 2． 1． 1 酵母  44
      2． 2． 1． 2 试剂  44
      2． 2． 1． 3 仪器  44
    2． 2． 2 方法  44-48
      2． 2． 2． 1 面包干酵母的活化  44-45
      2． 2． 2． 2 不同生长条件下酵母细胞的培养  45
      2． 2． 2． 3 酵母细胞不对称还原COBE的反应过程  45
      2． 2． 2． 4 细胞活性的检测  45
      2． 2． 2． 5 物的分离与检测  45-48
  2． 3 结果与讨论  48-58
    2． 3． 1 酵母不对称还原COBE的反应情况  48-51
    2． 3． 2 活性酵母细胞不对称还原COBE的反应进程曲线  51-52
    2． 3． 3 底物浓度对酵母细胞不对称还原COBE的影响  52-53
    2． 3． 4 产物对酵母细胞不对称还原COBE的抑制  53-54
    2． 3． 5 反应体系pH对酵母细胞不对称还原COBE的影响  54-55
    2． 3． 6 反应体系的温度对酵母细胞不对称还原COBE的影响  55-56
    2． 3． 7 辅助底物对酵母细胞不对称还原COBE的影响  56-57
    2． 3． 8 菌体培养条件对酵母细胞不对称还原COBE的影响  57-58
  2． 4 小结  58-59
  参考文献  59-62
第三章 控制活性酵母细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯立体选择性  62-84
  3． 1 前言  62-63
  3． 2 材料与方法  63-67
    3． 2． 1 材料  63
      3． 2． 1． 1 酵母  63
      3． 2． 1． 2 试剂  63
      3． 2． 1． 3 仪器  63
    3． 2． 2 方法  63-67
      3． 2． 2． 1 面包干酵母的活化  63
      3． 2． 2． 2 利用酶抑制剂对酵母的预处理  63-64
      3． 2． 2． 3 利用热对酵母的预处理  64
      3． 2． 2． 4 预处理后活性酵母细胞不对称还原COBE的反应过程  64
      3． 2． 2． 5 产物的分离与检测  64
      3． 2． 2． 6 预处理对粗酶液中还原COBE酶活影响的测定  64-65
      3． 2． 2． 7 预处理对酵母活性影响的测定  65-67
  3． 3 结果与讨论  67-80
    3． 3． 1 不同抑制剂预处理的情况  67-68
    3． 3． 2 控制反应的立体选择性促进S-CHBE的对映体过量值  68-73
      3． 3． 2． 1 热预处理促进S-型产物的对映体过量值  68-71
      3． 3． 2． 2 烯丙基醇预处理促进S-型产物的对映体过量值  71-73
    3． 3． 3 控制反应的立体选择性促进R-CHBE的对映体过量值  73-75
    3． 3． 4 预处理对酵母粗酶液中不对称还原COBE酶活的影响  75-78
      3． 3． 4． 1 热预处理对还COBE酶活性的影响  76-77
      3． 3． 4． 2 烯丙基醇预处理对还COBE酶活的影响  77-78
      3． 3． 4． 3 烯丙基溴预处理对还COBE酶活的影响  78
    3． 3． 5 预处理对酵母细胞活性的影响  78-80
      3． 3． 5． 1 热预处理对酵母活性的影响  78-79
      3． 3． 5． 2 烯丙基醇预处理对酵母活性的影响  79
      3． 3． 5． 3 烯丙基溴预处理对酵母活性的影响  79-80
  3． 4 小结  80-81
  参考文献  81-84
第四章 引入吸附树脂促进酵母细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯及其数学模拟  84-105
  4． 1 前言  84-86
  4． 2 材料与方法  86-89
    4． 2． 1 材料  86-87
      4． 2． 1． 1 酵母  86-87
      4． 2． 1． 2 试剂  87
      4． 2． 1． 3 树脂  87
      4． 2． 1． 4 仪器  87
    4． 2． 2 方法  87-89
      4． 2． 2． 1 面包干酵母的活化  87
      4． 2． 2． 2 树脂的前处理  87
      4． 2． 2． 3 树脂中的COBE在水相中释放比例的测定  87-88
      4． 2． 2． 4 水相中的CHBE在树脂相的吸附比例的测定  88
      4． 2． 2． 5 引入吸附树脂的酵母不对称还原COBE的反应过程  88
      4． 2． 2． 6 产物的分离与检测  88-89
  4． 3 结果与讨论  89-96
    4． 3． 1 树脂对COBE和CHBE的吸附特性  89-92
    4． 3． 2 树脂种类对促进酵母细胞不对称还原COBE的影响  92-93
    4． 3． 3 反应进程曲线的比较  93-94
    4． 3． 4 不同树脂的量对反应的影响  94-95
    4． 3． 5 不同底物浓度对反应的影响  95-96
  4． 4 过程的数学描述和拟合  96-101
    4． 4． 1 数学模型的建立  96-101
      4． 4． 1． 1 活性细胞催化羰基的不对称还原反应速率的描述  96-99
      4． 4． 1． 2 过程的描述  99
      4． 4． 1． 3 过程的数学描述  99-101
    4． 4． 2 反应过程的模拟  101
  4． 5 小结  101-102
  参考文献  102-105
第五章 活性酵母细胞催化苯乙酮的不对称还原及添加树脂对反应的促进作用  105-125
  5． 1 前言  105-106
  5． 2 材料与方法  106-108
    5． 2． 1 材料  106-107
      5． 2． 1． 1 酵母  106
      5． 2． 1． 2 化学试剂  106
      5． 2． 1． 3 树脂  106-107
      5． 2． 1． 4 仪器  107
    5． 2． 2 方法  107-108
      5． 2． 2． 1 包干酵母的活化  107
      5． 2． 2． 2 树脂的前处理  107
      5． 2． 2． 3 未加入树脂的酵母不对称还原ACP的反应过程  107
      5． 2． 2． 4 ACP和PEA对酵母细胞毒性的测定  107
      5． 2． 2． 5 加入树脂的酵母不对称还原ACP的反应过程  107-108
      5． 2． 2． 6 树脂对ACP和PEA吸附特性的测定  108
      5． 2． 2． 7 产物的分离与检测  108
  5． 3 结果与讨论  108-122
    5． 3． 1 水相体系中酵母不对称还原ACP的反应特性  108-116
      5． 3． 1． 1 酵母催化ACP的还原情况  108-111
      5． 3． 1． 2 活性酵母细胞不对称还原ACP的反应进程曲线  111-112
      5． 3． 1． 3 ACP浓度对酵母细胞不对称还原ACP的影响  112-113
      5． 3． 1． 4 反应体系pH对酵母细胞不对称还原ACP的影响  113
      5． 3． 1． 5 反应温度对酵母细胞不对称还原ACP的影响  113-114
      5． 3． 1． 6 细胞用量对酵母细胞不对称还原ACP的影响  114-115
      5． 3． 1． 7 辅助底物对酵母细胞不对称还原ACP的影响  115-116
      5． 3． 1． 8 酵母细胞对PEA的选择性氧化  116
    5． 3． 2 ACP和PEA对酵母细胞的毒性  116-118
      5． 3． 2． 1 ACP对酵母细胞的毒性  117
      5． 3． 2． 2 PEA对酵母细胞的毒性  117-118
    5． 3． 3 添加树脂后酵母细胞不对称还原ACP的情况  118-122
      5． 3． 3． 1 不同树脂对反应的影响  118-120
      5． 3． 3． 2 加入树脂时树脂的量对反应的影响  120-121
      5． 3． 3． 3 加入树脂时ACP浓度的影响  121-122
  5． 4 小结  122
  参考文献  122-125
第六章 活性酵母细胞催化2-辛酮的不对称还原反应特性  125-136
  6． 1 前言  125
  6． 2 材料与方法  125-127
    6． 2． 1 材料  125-126
      6． 2． 1． 1 菌种  125
      6． 2． 1． 2 试剂  125-126
      6． 2． 1． 3 仪器  126
    6． 2． 2 方法  126-127
      6． 2． 2． 1 菌体的培养与收集  126
      6． 2． 2． 2 酵母细胞不对称还原2-辛酮的反应过程  126
      6． 2． 2． 3 产物的分离与检测  126-127
  6． 3 结果与讨论  127-134
    6． 3． 1 活性酵母细胞转化2-辛酮的反应情况  127-128
    6． 3． 2 酵母细胞不对称还原2-辛酮的反应进程曲线  128-129
    6． 3． 3 底物浓度对酵母细胞不对称还原2-辛酮的影响  129-130
    6． 3． 4 物对酵母细胞不对称还原2-辛酮的抑制  130-131
    6． 3． 5 反应体系pH对酵母细胞不对称还原2-辛酮的影响 116  131-132
    6． 3． 6 反应体系温度对酵母细胞不对称还原2-辛酮的影响  132
    6． 3． 7 辅助底物对酵母细胞不对称还原2-辛酮的影响  132-134
  6． 4 小结  134
  参考文献  134-136
第七章 结论与展望  136-139
  7． 1 结论  136-138
  7． 2 展望  138-139
攻读博士学位期间发表的学术论文  139-140
致谢  140

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