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微生物法不对称还原β羰基苯丙酸乙酯制备（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯的研究

作　者: 陈晓彦
导　师: 应国清；欧志敏
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化工
关键词: 不对称还原 Saccharomyces cerevisiae B5 β-羰基苯丙酸乙酯 (S)-(-)-β-羟基苯丙酸乙酯
分类号: TQ245.24
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本文对微生物法不对称还原β羰基苯丙酸乙酯制备（S） （ ）β羟基苯丙酸乙酯的反应进行了研究。通过对实验室保藏菌种进行筛选,获得一株对底物还原能力较强的菌株Saccharomyces cerevisiae B5,并对还原条件进行优化,确定了反应的最优条件为:采用初始pH为8.0的液体发酵培养基培养的Saccharomyces cerevisiae B5经过50℃预热处理30 min后用于生物转化,转化条件为pH7.0,温度30℃,转化时间24 h,底物浓度为3.63 mmol/L,菌体用量为86 g/L（干重/反应体积）,以10%葡萄糖为辅助底物。在最佳转化条件下反应转化率及（S） （ ）β羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值可分别达到98.4%和100%ee。将得到的（S） （ ）β羟基苯丙酸乙酯粗品用溶剂萃取和柱色谱相结合的方法进行分离纯化。转化液经离心弃去微生物细胞后用正己烷萃取上清液,萃取液经蒸馏除去正己烷后,获得的样品用硅胶柱进行层析分离。硅胶柱层析的最佳洗脱条件为:洗脱液石油醚与乙酸乙酯的体积比为7:1,洗脱液流速为1.5 ml/min,上样量为4.8 mg/ml硅胶,径高比为1:12。获得的（S） （ ）β羟基苯丙酸乙酯的纯度为98.2%,对映体过剩值为97.5%。通过对还原反应过程中细胞内NADP和NADPH的浓度进行测定,确定参与不对称还原的辅酶为NADPH。通过测定反应过程中底物和产物浓度的实验数据对动力学方程进行拟合,得到动力学参数为: vm=5.0×10-4 mol·L-1·h-1, k1=1.5×10-6 mol·L-1·h-1, k2=3.0×10-3 mol·L-1·h-1。动力学模型为:动力学模型能较好地拟合实验数据。在膜反应器中对微生物还原制备（S）-（-）-β-羟基苯丙酸乙酯的连续反应进行了研究,考察了操作条件对反应器生产能力及底物转化率的影响,并建立了连续反应过程的动力学模型。确定了合适的超滤膜截留分子量为30 KDa,在0.1 MPa的压力下进行连续反应,生物量为86 g/L,膜通量为20 ml/min,所能达到的最大生产能力为0.136 h-1。底物处理量为18.29 mmol时连续反应7 d产物的产率为3.68 mmol·L-1·d-1。150 ml生物量为86 g/L菌液一次性转化18.29 mmol底物的转化率为零。可见,连续反应的转化率远远高于分批反应的结果。连续反应可以解除高底物浓度对反应过程的抑制。对连续反应过程建立的动力学模型能较好地拟合实验数据,得到的动力学参数为:vm=3.0×10-3 mol·L-1·h-1,kcat=3.5×10-4 mol·L-1·h-1,k1=3.1×10-2 mol·L-1,k2=5.0×10-7 mol·L-1。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
前言  13-15
第一章 绪论  15-29
  1.1 手性药物合成的意义  15
  1.2 手性化合物的制备方法  15-18
    1.2.1 药物对映体拆分法  15-16
    1.2.2 手性源合成法  16-17
    1.2.3 潜手性化合物不对称合成法  17
    1.2.4 生物法合成手性药物  17-18
  1.3 微生物转化  18-23
    1.3.1 微生物转化研究概况  18
    1.3.2 微生物转化反应的类型  18-20
    1.3.3 微生物转化的主要方法  20-22
    1.3.4 影响微生物转化反应的因素  22-23
  1.4 微生物法不对称还原羰基化合物制备手性醇  23-25
    1.4.1 微生物法不对称还原羰基化合物制备手性醇的特点  23-24
    1.4.2 反应机理  24-25
  1.5 膜生物反应器(MBR)技术  25-26
    1.5.1 膜生物反应器的分类  25-26
    1.5.2 膜生物反应器的特点  26
    1.5.3 膜生物反应器在生物转化中的应用  26
  1.6 (S)-(-)-β羟基苯丙酸乙酯简介  26-27
  1.7 本论文的结构  27-29
第二章 微生物法还原β-基苯丙酸乙酯制备(S)-(-)-β羟基苯丙酸乙酯  29-40
  2.1 引言  29
  2.2 材料与方法  29-32
    2.2.1 菌种  29
    2.2.2 培养基  29-30
    2.2.3 试剂与仪器  30
    2.2.4 菌体培养  30
    2.2.5 还原反应  30
    2.2.6 底物与产物的检测  30-32
    2.2.7 数据处理方法  32
  2.3 结果与讨论  32-39
    2.3.1 菌种筛选  32-33
    2.3.2 液体培养基的初始pH 值对还原反应的影响  33-34
    2.3.3 预热处理酵母细胞对还原反应的影响  34-35
    2.3.4 还原反应体系初始pH 值对还原反应的影响  35
    2.3.5 转化温度对还原反应的影响  35-36
    2.3.6 反应时间对还原反应的影响  36
    2.3.7 底物浓度对还原反应的影响  36-37
    2.3.8 生物量对还原反应的影响  37-38
    2.3.9 辅助底物的种类及添加量对还原转化率的影响  38-39
  2.4 小结  39-40
第三章 从微生物转化液中分离纯化(S)-(-)-β羟基苯丙酸乙酯  40-47
  3.1 实验方法  40-41
    3.1.1 菌种及培养基  40
    3.1.2 试剂  40
    3.1.3 仪器  40
    3.1.4 菌体培养  40-41
    3.1.5 还原反应  41
    3.1.6 产物粗品提取  41
    3.1.7 薄板层析  41
    3.1.8 柱层析  41
  3.2 结果与讨论  41-46
    3.2.1 (S)-(-)-β羟基苯丙酸乙酯的粗提  41-42
    3.2.2 展开剂的选择  42-43
    3.2.3 展开剂的配比选择  43-44
    3.2.4 上样量对产物纯度的影响  44
    3.2.5 流动相流速对产物纯度的影响  44-45
    3.2.6 硅胶柱径高比对产物纯度的影响  45-46
  3.3 小结  46-47
第四章 微生物法还原β-基苯丙酸乙酯制备(S)-(-)-β羟基苯丙酸乙酯的分批反应动力学研究  47-63
  4.1 分批培养转化法  47
  4.2 反应机理  47-48
  4.3 模型的推导  48-53
  4.4 材料与方法  53-57
    4.4.1 菌种及培养基  53
    4.4.2 试剂与仪器  53
    4.4.3 菌体培养  53
    4.4.4 还原反应  53
    4.4.5 分析方法  53-57
  4.5 结果与讨论  57-62
    4.5.1 以葡萄糖为辅助底物时，参与还原反应的辅酶种类与含量  57-58
    4.5.2 从实验数据模型拟合参数  58-59
    4.5.3 实验数据与模型数据的比较  59-61
    4.5.4 NADPH 及底物浓度对反应速率的影响  61-62
  4.6 小结  62-63
第五章 微生物法还原β-基苯丙酸乙酯制备(S)-(-)-β羟基苯丙酸乙酯的连续反应动力学研究  63-73
  5.1 引言  63
  5.2 材料与方法  63-65
    5.2.1 菌种及培养基  63
    5.2.2 试剂  63
    5.2.3 仪器  63
    5.2.4 菌体培养  63
    5.2.5 连续转化反应  63-64
    5.2.6 分析方法  64-65
  5.3 动力学模型的推导  65
  5.4 结果与讨论  65-71
    5.4.1 压力对膜通量的影响及超滤膜截留分子量的选择  65-66
    5.4.2 膜通量的衰减  66-67
    5.4.3 生物量对膜通量的影响  67-68
    5.4.4 细胞与底物质量浓度比(c_(e0)/c_(50))对反应器生产能力的影响  68-69
    5.4.5 平均停留时间对反应器生产能力的影响  69-70
    5.4.6 最佳工艺的确定  70
    5.4.7 连续反应与分批反应产物产量的比较  70
    5.4.8 动力学常数与反应器参数  70-71
  5.5 小结  71-73
结论与展望  73-75
  1 结论  73-74
  2 展望  74-75
参考文献  75-81
致谢  81-82
附录作者在攻读硕士学位期间发表的论文  82

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 基本有机化学工业 > 芳香族化合物的生产 > 芳香族羧酸及其衍生物 > 芳酸的功能衍生物 > 芳酸酯
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