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生物法催化水解外消旋安息香酸薄荷酯制备左旋薄荷醇的研究

作　者: NGO THI MINH THU
导　师: 许建和；郑高伟
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 生物催化酶促水解动力学拆分 dl-安息香酸薄荷酯 l-薄荷醇微生物筛选不动杆菌
分类号: TQ651.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

l-薄荷醇是一个很重要的香料化学品。由于它独特香气和清凉效果被广泛用于医药、食品、烟草、化妆品及口腔保健等产品。由于生物催化反应具有高效、高选择性、副产物少、安全和环境友好等优点,所以近年来利用生物催化对映选择性拆分技术制备l-薄荷醇的研究引起了学术界和工业界的广泛关注。安息香酸薄荷酯作为一个重要的拆分底物已被用于千吨级左旋薄荷醇的工业生产。本文的目的是以外消旋安息香酸薄荷酯作为底物,建立一个酶促对映选择性水解制备左旋薄荷醇的生物催化过程。本论文的主要工作包括以下两个部分：第一,高效生物催化剂的定向筛选。以待拆分的底物(dl-安息香酸薄荷酯)作为微生物富集培养的唯一碳源,以目标产物(l-薄荷醇)的产量和纯度作为筛选的指针。从土样分离得到的341个微生物菌落中,通过薄板层析(TLC)初筛得到129株具有目标反应活性的菌株,通过对其中活性较高的酯酶产生菌的复筛,获得13株对目标底物转化较好且所得产物光学纯度在80%ee以上的菌株。对13株候选菌株的底物耐受性进一步考察,最终筛选到一株具有高选择性和高水解活性的生物催化剂。该菌株经16S rDNA鉴定,确定属于不动杆菌类,命名为Acinetobacter sp.ECU2040。第二,Acinetobacter sp.ECU2040的催化特性与过程优化及放大研究。经过优化,确定最佳反应温度为37℃,最佳反应pH为7.5,最佳乳化剂是吐温-80,其最适添加浓度为0.5%(w/v)。在最适反应条件下,它能够较好地催化外消旋混合物中l-薄荷酯的对映选择性水解生成左旋的l-薄荷醇。此外,还考查了酶的底物耐受性,确定不动杆菌酯酶最适的反应底物浓度可达10mM。最后将该反应扩大到1升规模,底物转化率仍可达到48%,表明该酶催化的反应过程具有进一步开发和较好的潜在应用前景。

全文目录

Abstract  5-7
摘要  7-11
Chapter 1 Introduction  11-29
  1.1. Chirality  11-13
  1.2. Chirality in bio-industry  13-15
  1.3. l-Menthol  15-16
  1.4. Application of menthol  16-17
  1.5. The research on production of menthol in the world  17-27
    1.5.1. Extraction from natural plants  18
    1.5.2. Chemical synthesis  18-22
    1.5.3. Biosynthesis  22-27
      1.5.3.1. Enzymatic enatioselective esterification or transesterification  23-25
      1.5.3.2. Enzymatic enantioselective hydrolysis  25-27
  1.6. The main content and objective of this study  27-29
Chapter 2 Screening of biocatalysts for enantioselective hydrolysis of dl-menthyl benzoate to l-menthol  29-47
  2.1. Forewords  29-30
  2.2. Main process for strain screening  30-32
  2.3. Materials and methods  32-37
    2.3.1. Main materials and apparatuses  32-33
    2.3.2. Soil samples  33
    2.3.3. Culture medium  33-34
    2.3.4. Analytic methods  34
      2.3.4.1. Thin layer chromatoraphy (TLC) analysis  34
      2.3.4.2. Gas chromatography (GC) analysis  34
      2.3.4.3. High-performance liquid chromatography(HPLC)  34
    2.3.5. Experimental methods  34-37
      2.3.5.1. Chemical synthesis of racemic menthyl benzoate  34-35
      2.3.5.2. Soil sample collection  35
      2.3.5.3. Enrichment culture  35
      2.3.5.4. Isolated strains  35-36
      2.3.5.5. Preliminary screening  36
      2.3.5.6. Reselection of target strains  36
      2.3.5.7. Crude enzyme preparation  36-37
      2.3.5.8. Strain identification  37
  2.4. Results and discussion  37-46
    2.4.1. Chemical synthesis of racemic menthyl benzoate  37-38
    2.4.2. Calibration curve of menthol concentration  38-39
    2.4.3. The results of isolated microbial strains from soil samples  39
    2.4.4. Isolated strains  39
    2.4.5. Preliminary screening  39-40
    2.4.6. Reselection and confirmation  40-43
    2.4.7. Strain identification  43-45
    2.4.8. Fermentation process of Acinetobacter sp.ECU2040  45-46
  2.5. Summary  46-47
Chapter 3 The process study of enzymatic hydrolysis for l-menthol production  47-61
  3.1. Forewords  47
  3.2. Materials and apparatuses  47-51
    3.2.1. Main materials and apparatuses  47-49
    3.2.2. Analytic methods  49
      3.2.2.1. Thin layer liquid chromatography(TLC)analysis  49
      3.2.2.2. Gas chromatography analysis(GC)  49
      3.2.2.3. High-performance liquid chromatography(HPLC)  49
      3.2.2.4. Enzyme activity assays  49
    3.2.3. Experimental methods  49-51
      3.2.3.1. Cultivation  49-50
      3.2.3.2. Effect of pH  50
      3.2.3.3. Effect of temperature  50
      3.2.3.4. Effect of surfactants  50
      3.2.3.5. Effect of substrate concentration on the enzyme tolerance  50
      3.2.3.6. Enzymatic hydrolysis of different dl-menthyl esters  50-51
      3.2.3.7. The scale-up of l-menthol production  51
  3.3. Results and discussion  51-60
    3.3.1. Effect of pH  51-52
    3.3.2. Effect of temperature  52-53
    3.3.3. Effect of surfactants  53-56
    3.3.4. Effect of substrate concentration on enzyme tolerance  56-57
    3.3.5. Enzymatic hydrolysis of different dl-menthyl esters  57-59
    3.3.6. Scale up of bioreaction and preparation of l-menthol product  59-60
  3.4. Summary  60-61
References  61-66
Acknowledgements  66

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