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转基因玉米中外源基因检测方法的研究

作　者: 郭燕风
导　师: 杨正友
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 热不对称交错PCR 反向PCR 转化事件标准质粒实时PCR
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

自1983年首例转基因作物问世以来,在给人类带来巨大福音的同时也带来了潜在的风险,转基因作物安全问题也逐渐被人们重视。各国政府纷纷制定相关政策法规,要求对转基因作物及其产品实施标识管理制度。这些法规实施的前提就是要建立一套稳定、准确的转基因检测技术。本研究以转基因玉米MON810为材料,在构建标准质粒的基础上,建立了对MON810定性PCR和荧光定量PCR检测方法,主要研究结果如下:1、为了获得高质量的基因组DNA,本研究比较了多种提取玉米叶片组织和玉米种子基因组DNA的方法,并对其进行了优化,得到了玉米叶片组织和种子基因组DNA的最佳提取方法,进而为在核酸方面检测转基因作物提供了依据。2、分别通过Tail-PCR和I-PCR的方法获得了MON810的左边界序列,比较了两种方法的难易程度,Tail-PCR实验过程简单但结果分析繁琐;I-PCR实验过程繁琐但结果分析简单,从本文的实验情况来看,选择I-PCR为获得边界序列的主要方法。3、通过重叠延伸PCR的方法将MON810的左边界序列mt及外源基因CaMV35S启动子、hsp70、cry1Ab连接成一个大片段,经过纯化,再将其连接到pMD18-T载体,最后通过双酶切的方法将玉米内标基因SSⅡb连入同一载体,构成适于MON810检测的标准质粒pMD-MON810。4、根据MON810转入的外源基因,设计了针对CaMV35S、hsp70和cry1Ab的引物,并且设计了针对左边界序列和内标基因的引物,从而建立了MON810品系的定性检测系统。5、建立了基于染料SYBR GreenⅠ荧光PCR的定量检测体系,利用标准质粒建立的线性回归方程,计算出未知样品的转基因含量。定量体系的检测灵敏度达到50个拷贝,可以完全满足国际上对转基因定量检测的需要。

全文目录

中文摘要  9-10
英文摘要  10-12
1 前言  12-30
  1.1 转基因生物的安全性  12-13
    1.1.1 转基因生物  12
    1.1.2 转基因生物的安全管理现状  12-13
  1.2 转基因作物现状  13-14
  1.3 转基因玉米研究进展  14-15
    1.3.1 抗虫转基因玉米  14
    1.3.2 转基因玉米中的外源基因  14-15
  1.4 转基因作物的检测  15-23
    1.4.1 核酸检测方法  15-20
      1.4.1.1 定性PCR  15-16
      1.4.1.2 定量PCR  16-18
      1.4.1.3 多重PCR  18-19
      1.4.1.4 巢式PCR 和半巢式PCR  19
      1.4.1.5 基因芯片技术  19-20
    1.4.2 蛋白质检测方法  20-22
      1.4.2.1 ELISA  20-21
      1.4.2.2 侧流试纸条检测(Lateral Flow strip)  21
      1.4.2.3 Western 杂交  21-22
    1.4.3 其它检测方法  22-23
      1.4.3.1 色谱法  22
      1.4.3.2 近红外光谱法  22
      1.4.3.3 生物传感器法  22
      1.4.3.4 微装置系统  22-23
      1.4.3.5 纳米转基因检测技术  23
      1.4.3.6 Southern Blot 法  23
      1.4.3.7 荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization)  23
  1.5 几种商品化的转基因玉米质粒图谱信息平台的构建  23-24
  1.6 转基因植物中侧翼序列获得方法的研究  24-28
    1.6.1 热不对称交错PCR(TAIL-PCR )  24-26
    1.6.2 反向PCR(I-PCR)  26
    1.6.3 捕获PCR(Capture PCR)  26
    1.6.4 T 接头PCR (T-linker PCR)  26-28
  1.7 标准物质的研制  28-30
    1.7.1 标准物质简介  28
    1.7.2 质粒标准分子  28-30
      1.7.2.1 质粒标准分子研制方法  28-29
      1.7.2.2 质粒标准分子的作用  29-30
2 材料和方法  30-52
  2.1 材料  30-34
    2.1.1 转基因材料  30
    2.1.2 非转基因材料  30
    2.1.3 酶和生化试剂  30-31
    2.1.4 引物  31
    2.1.5 实验室所配置试剂  31-33
      2.1.5.1 玉米叶片基因组提取液  32
      2.1.5.2 玉米种子基因组提取液  32-33
    2.1.6 主要仪器  33-34
  2.2 方法  34-52
    2.2.1 提取玉米叶片组织基因组的方法  34-37
      2.2.1.1 方法一  34
      2.2.1.2 方法二  34-35
      2.2.1.3 方法三  35
      2.2.1.4 方法四  35
      2.2.1.5 方法五  35-36
      2.2.1.6 方法六  36
      2.2.1.7 方法七  36-37
      2.2.1.8 方法八  37
    2.2.2 提取玉米种子基因组的方法  37-40
      2.2.2.1 方法一  37-38
      2.2.2.2 方法二  38
      2.2.2.3 方法三  38-39
      2.2.2.4 方法四  39
      2.2.2.5 方法五  39-40
    2.2.3 重组质粒的转化  40
    2.2.4 MON810 转基因元件的检测  40-41
      2.2.4.1 SS Ⅱb 基因的检测  40-41
      2.2.4.2 CaMV35S启动子的检测  41
      2.2.4.3 hsp70 基因的检测  41
      2.2.4.4 cry1Ab 基因的检测  41
    2.2.5 扩增MON810 5′侧翼序列  41-43
      2.2.5.1 Tail-PCR 获得MON810 5′侧翼序列  41-42
      2.2.5.2 反向PCR（I-PCR）获得MON810 5′侧翼序列  42-43
    2.2.6 构建适于MON810 检测的标准质粒  43-49
      2.2.6.1 扩增小片段  44
      2.2.6.2 重叠延伸mt-mp35S 片段与mhsp-mcry1Ab 片段  44-47
      2.2.6.3 重叠延伸mt-mp35S-mhsp-mcry1Ab 大片段  47-48
      2.2.6.4 重叠延伸的mt-mp35S-mhsp-mcry1Ab 大片段转化宿主菌  48
      2.2.6.5 玉米内标基因连接重组载体  48-49
    2.2.7 以标准质粒为阳性标准品检测MON810  49-50
      2.2.7.1 检测cry1Ab  49-50
      2.2.7.2 检测MON810 转化事件  50
    2.2.8 荧光定量 PCR 检测  50-52
      2.2.8.1 稀释标准质粒  50
      2.2.8.2 鉴定检测极限（LOD）和定量极限（LOQ）  50
      2.2.8.3 建立标准曲线和重复性分析  50
      2.2.8.4 校正系数的确定  50-51
      2.2.8.5 定量实际样品  51-52
3 结果和分析  52-69
  3.1 玉米叶片组织基因组的提取及质量鉴定结果  52-54
  3.2 玉米种子基因组的提取及质量鉴定结果  54-57
  3.3 MON810 转基因元件检测结果  57-58
  3.4 获得MON810 的左边界序列  58-60
    3.4.1 Tail-PCR 的方法获得侧翼序列  58-59
    3.4.2 反向PCR（I-PCR）的方法获得侧翼序列  59-60
  3.5 MON810 标准质粒的构建结果  60-63
  3.6 以标准质粒为阳性标准品对 MON810 定性检测结果  63-64
  3.7 荧光定量检测  64-69
    3.7.1 检测极限和定量极限的鉴定结果  64-65
    3.7.2 标准曲线的建立  65-68
    3.7.3 实际样品的检测结果  68-69
4 讨论  69-73
5 结论  73-74
参考文献  74-80
致谢  80

转基因玉米中外源基因检测方法的研究

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