学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

苹果IRAP体系的建立及苹果芽变无性系的鉴定

作　者: 周军永
导　师: 孙俊；孙其宝
学　校: 安徽农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果逆转录转座子 IRAP-PCR 指纹图谱 SCAR标记反向PCR
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 63次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

苹果（Malus domestica Borka）是世界范围内一种重要的果树之一,在长期进化过程中形成了丰富的遗传多样性。本研究以苹果属元帅系和富士系芽变品种为试材,建立了苹果属植物逆转录转座子间扩增多态性（Inter-retrotransposon amplified polymo- rphism,IRAP）技术体系,利用此体系构建了元帅系和富士系芽变品种的指纹图谱,进行了苹果芽变无性系的鉴定。利用ARL5引物在芽变品种‘玫瑰红’中发现了一条特异片段,根据对此片段分析结果,设计1对引物,成功将IRAP标记转化为特征性片段扩增区域（Sequence characterized amplified region,SCAR）标记;利用反向PCR（Inverse PCR,IPCR）技术克隆了其侧翼的未知序列,为进一步探明苹果芽变机理和基因功能奠定技术基础。1、利用已获得的苹果Ty1-copia类逆转座子LTRs建立了苹果IRAP技术体系,对影响IRAP-PCR扩增结果的若干因子进行了研究。优化的体系包含:25μL反应体系中,10×buffer 2.5μL、模板DNA 50 ng、Mg²⁺ 2.5 mmo1-L^-1、dNTPs 0.2 mmo1-L^-1、引物0.4μmo1-L^-1、TaqDNA聚合酶1 U;优化的PCR扩增程序为:94℃2 min,94℃l min,退火1 min,72℃2 min,循环35次;72℃延伸10 min;退火温度根据引物温度设定。试验证明利用该体系在供试芽变品种中获得了较为理想的扩增结果。2、利用自己开发的IRAP引物对15个元帅无性系芽变和16个富士无性系芽变进行了鉴定。所有引物在两类无性系芽变中均扩增出丰富的条带,且表现出多态性。以相似系数0.76为标准,供试的15个元帅无性系变异经SAHN聚类可聚为4类:第一类包括‘元帅’、‘居家店短红星’、‘艳红’、‘米勒矮生’、‘矮壮’、‘红星’、‘红冠’、‘矮威尔’、‘早红星’和‘华帅一号’;第二类包括‘玫瑰红’、‘奥勒冈矮生’和‘矮红’;‘新红星’和‘哈蒂.勃莱特’分别独自成类。以相似系数0.74为标准,供试的16个富士芽变无性系可聚为5类,第一类包括‘长富3’、‘盛放富1’、‘长富6’、‘群富1’、‘烟富1’、‘竽井Ⅱ系’、‘岩手Ⅰ系’、‘富士Ⅰ系’、‘红王将’和‘长富7’;第二类包括‘富士’和‘秋富5’;第三类包括‘秋富1’和‘秋富2’;‘长野Ⅰ系’和‘斋藤Ⅱ系’分别独自成类。本研究结果表明逆转座子在苹果基因组内的插入方向具有随意性,转座插入和逆转座子间重组是引起苹果无性系变异的两个重要机制,本试验所开发的引物是进行苹果无性系变异研究的有力工具,为进一步阐明苹果无性系变异机理奠定了基础。3、利用ARL5引物从元帅短枝芽变品种‘玫瑰红’中发现了一条特异片段,测定了其序列;并成功将IRAP标记转化为SCAR标记。建立的SCAR标记体系为:反应总体积为25μL,内含模板DNA50 ng,10×Buffer 2.5μL,Mg²⁺ 3.0 mmo1^L-1,dNTPs 0.2 mmo1-L^-1,引物各0.2μmo1-L^-1,Taq DNA聚合酶1 U。本试验成功将IRAP标记转化为SCAR标记,为苹果的分子标记辅助育种工作奠定基础。4、反向PCR技术是对已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究的方法。本试验建立了IPCR酶切体系:50μL的体系中含有2μg基因组DNA、5 U限制性内切酶HindⅢ;酶切产物环化自连体系:50μL体系中约0.8μg单酶切基因组DNA、5μL10×T4连接缓冲液、5 U T4DNA连接酶,16℃连接过夜;IPCR反应体系:50μL体系中约40 ng环化自连接产物、5μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺ plus)、0.2 mmo1-L^-1 dNTPs、0.4μmo1-L^-1IP1和IP2引物、2.5 U TaKaRa LA Taq聚合酶。IPCR扩增程序为:94℃4 min,94℃l min,60℃1.5 min,72℃4 min,循环35次;72℃10 min。利用建立的IPCR技术成功克隆了长度为1.5kb的特异片段旁侧序列。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 文献综述  10-18
  1.1 苹果芽变育种的意义及现状  10-11
    1.1.1 苹果芽变育种的意义  10
    1.1.2 苹果芽变育种的现状  10-11
  1.2 芽变鉴定技术的发展  11-12
    1.2.1 形态学鉴定在芽变鉴定中的应用  11
    1.2.2 染色体染色体数量与结构变异检测  11
    1.2.3 同工酶分析的应用  11
    1.2.4 孢粉学在品种鉴定中的应用  11
    1.2.5 分子标记在芽变鉴定中的应用  11-12
  1.3 芽变机理的探讨  12-13
  1.4 植物逆转座子研究进展  13-16
    1.4.1 逆转座子类型和逆转座子分布  13
    1.4.2 逆转座子在基因组中的作用  13-14
    1.4.3 建立起来的基于逆转座子的分子标记  14
    1.4.4 Ty1-copia 类逆转座子RNaseH-LTR 序列的分离  14
    1.4.5 逆转座子的应用  14-16
  1.5 特异片段转化SCAR 标记的研究  16
  1.6 反向PCR 技术扩增已知片段旁侧序列的研究  16-17
  1.7 展望  17-18
2 引言  18-20
  2.1 研究目的与意义  18
  2.2 研究内容  18-20
    2.2.1 苹果IRAP 技术体系的建立  18
    2.2.2 苹果芽变无性系的IRAP 分析  18
    2.2.3 元帅短枝品种特异片段的SCAR 标记转化  18-19
    2.2.4 反向PCR 技术扩增特异片段的旁侧序列  19-20
3 材料与方法  20-25
  3.1 材料  20-21
  3.2 试验方法  21-25
    3.2.1 基因组DNA 的提取  21
    3.2.2 DNA 的检测与定量  21
    3.2.3 目的产物的回收与纯化  21-22
    3.2.4 回收产物与pMD18-T 载体的连接  22
    3.2.5 大肠杆菌DH5a 感受态细胞的制备及质粒的转化  22
    3.2.6 IRAP-PCR 反应条件的优化  22-23
    3.2.7 芽变品种的聚类分析  23-24
    3.2.8 短枝芽变变异位点的SCAR 标记的建立  24
    3.2.9 IPCR 技术扩增特异片段的旁侧序列  24-25
4 结果与分析  25-33
  4.1 苹果基因组DNA 检测  25
  4.2 IRAP—PCR 扩增程序的建立  25-27
    4.2.1 不同组分浓度对IRAP-PCR 体系的影响  25-26
    4.2.2 不同退火温度对IRAP 体系的影响  26-27
  4.3 苹果无性系芽变的IRAP 扩增结果分析  27-30
    4.3.1 苹果无性系芽变的IRAP 多态性分析  27
    4.3.2 具有IRAP 特征谱带的苹果无性系芽变分析  27-28
    4.3.3 聚类分析  28-30
  4.4 短枝芽变位点的SCAR 标记的建立  30-31
    4.4.1 ‘ 玫瑰红’短枝芽变IRAP 特异位点标记  30
    4.4.2 Mgha115-750 的克隆和测序结果  30
    4.4.3 SCAR 标记引物的设计与扩增体系的建立  30-31
  4.5 反向PCR 克隆‘玫瑰红’特异片段旁侧序列  31-33
    4.5.1 酶切与自身环化连接体系  31
    4.5.2 IPCR 反应体系  31
    4.5.3 特异片段旁侧序列的克隆与测序  31-33
5 讨论  33-36
  5.1 IRAP 标记体系的影响因素  33
  5.2 IPAR 标记在芽变鉴定和遗传性研究方面的潜力  33-34
  5.3 特异片段SCAR 标记的建立  34
  5.4 反向PCR 克隆旁侧序列存在问题  34-36
6 结论  36-37
参考文献  37-43
附录  43-49
致谢  49-50
作者简介  50

苹果IRAP体系的建立及苹果芽变无性系的鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文