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边缘无浆体荧光定量PCR检测及MSP4基因序列分析

作　者: 徐平源
导　师: 胡述光；刘毅；何德肆
学　校: 湖南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 边缘无浆体 MSP4基因序列分析 SYBR-Green I 标准质粒
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究的第一部份旨在阐明边缘无浆体MSP4基因部分序列(pMSP4)的遗传变异情况。应用聚合酶链反应(PCR)扩增边缘无浆体虫株的MSP4基因的部分序列(pMSP4),再将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果表明,来自湖南省的六株边缘pMSP4的序列长度一致,均为530bp,与GenBankTM公布的边缘无浆体相应序列相似性在98.3%以上,与其它无浆体的差异大于9.7%。由于边缘无浆体pMSP4序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记。本研究为进一步的分子流行病学调查及相关疾病打下了良好基础。本研究的第二部份旨在建立SYBR-Green I荧光定量PCR检测边缘无浆的方法,并进行实验室方法学评价。设计引物AmspF4/R4并克隆MSP4部分基因,构建的含有MSP4基因的的标准质粒pEASY-T3-MSP4,以构建的标准质粒为模板,用AmspF3/R3为引物进行荧光定量PCR,建立了MSP4 SYBRGreen I荧光定量PCR标准曲线,结果表明,该方法可以检测到104copies/μL个拷贝数的标准质粒DNA,该方法对附红细胞体、猪带绦虫、异刺线虫、组织滴虫提取的DNA均为阴性反应。与常规PCR方法比较,该方法更敏感、重复性好、无污染特性,并具有能准确定量。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章文献综述  10-26
  1 无浆体病研究进展  10-17
    1.1 病原体  10-11
    1.2 流行病学  11
    1.3 临床症状及病理变化  11-12
      1.3.1 临床症状  11-12
      1.3.2 病理变化  12
    1.4 表面蛋白  12-14
    1.5 免疫机制  14-15
    1.6 诊断  15-17
      1.6.1 常规检查  15
      1.6.2 学清学诊断  15-16
      1.6.3 分子生物学检测  16-17
  2 荧光定量PCR检测技术  17-20
    2.1 常见定量PCR方法  19-20
      2.1.1 内参照法  19
      2.1.2 竞争法  19
      2.1.3 PCR-ELISA法  19-20
  参考文献  20-26
第二章边缘无浆体长沙株的MSP4基因的克隆及序列分析  26-38
  1 材料与方法  26-31
    1.1 材料  26-28
      1.1.1 样品  26-27
      1.1.2 试剂  27
      1.1.3 载体  27
      1.1.4 仪器及设备  27-28
    1.2 方法  28-31
      1.2.1 涂片镜检  28
      1.2.2 引物设计  28
      1.2.3 样品DNA的制备  28-29
      1.2.4 PCR扩增  29
      1.2.5 样品PCR扩增产物的回收与纯  29-30
      1.2.6 扩增片段的克隆及筛选  30
      1.2.7 序列测定  30
      1.2.8 序列分析  30-31
  2 结果与分析  31-35
    2.1 血涂片结果  31-32
    2.2 PCR扩增结果  32-33
    2.3 阳性克隆鉴定结果  33
    2.4 测序结果及分析  33-35
    2.5 MSP4基因序列同源性比较  35
  3 讨论  35-37
  参考文献  37-38
第三章边缘无浆体SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的初步建立  38-52
  1 材料与方法  38-44
    1.1 材料  38-39
      1.1.1 毒株及菌种  38
      1.1.2 试剂  38-39
      1.1.3 仪器与设备  39
    1.2 方法  39-44
      1.2.1 引物设计和合成  39
      1.2.2 边缘无浆体基因组的提取  39
      1.2.3 常规PCR以及产物回收  39-40
      1.2.4 PCR产物的连接  40
      1.2.5 连接产物的转化  40-41
      1.2.6 重组质粒的鉴定  41-42
      1.2.7 重组质粒的测序鉴定  42
      1.2.8 定量标准曲线的建立  42-44
        1.2.8.1 标准质粒的制备  42-43
        1.2.8.2 扩增曲线的建立  43
        1.2.8.3 SYBR GREENⅠ荧光定量PCR的反应条件  43-44
        1.2.8.4 实时荧光定量PCR的特异性、敏感性、重复性的检测  44
        1.2.8.5 标准曲线的建立  44
        1.2.8.6 熔解曲线的建立  44
      1.2.9 临床样品检测结果  44
  2 结果  44-49
    2.1 PCR扩增结果  44-45
    2.2 阳性克隆鉴定结果  45
    2.3 荧光定量PCR反应体系优化结果  45-46
    2.4 标准品扩增曲线  46
    2.5 标准曲线  46-47
    2.6 溶解曲线分析  47
    2.7 标准品重复性检测  47-48
    2.8 特异性检测  48
    2.9 临床样本检测结果  48-49
  3 讨论  49-51
  参考文献  51-52
第四章全文总结  52-53
附录  53-55
  缓冲液及其它溶液  53-55
符号说明  55-56
致谢  56

边缘无浆体荧光定量PCR检测及MSP4基因序列分析

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