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转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立

作　者: 刘凌
导　师: 彭于发
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物安全
关键词: 转基因水稻“Bt汕优63” 检测 转化事件特异性 PCR 目的基因表达
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 253次
引　用: 2次
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内容摘要


我国对转基因水稻的研究处于世界领先水平,其中,研发的一些抗病、抗虫转基因水稻品系已经进入申请生产种植用生物安全证书阶段,但由于它们的转基因生物安全问题等一些原因,至今尚未有品系批准商业化生产应用。而分子特征分析是对转基因作物进行生物安全性评价的一个重要方面。我国和国际上许多国家的转基因生物安全管理法规都有这方面的资料要求。因此,本研究以尚未进入商业化生产的转基因水稻“Bt汕优63”为研究对象,利用普通PCR、长链PCR、反转录PCR和荧光定量PCR等方法,从其DNA水平、RNA水平进行研究,主要研究内容和结果有以下四个方面:1.验证了基因枪转化的转cry1Ab/c融合基因水稻品系“Bt汕优63”的外源插入DNA的结构,证明其确实有部分标记基因片段存在。验证了其转化事件定性检测体系。并检测了其自交产生的下一代植株的外源插入结构,发现标记基因部分片段依然存在,外源基因的分离比符合单位点的孟德尔遗传。2.根据侧翼序列优化设计特异性引物,以转基因水稻种属特异性基因作为PCR扩增的内源参照,建立转化事件特异性定量检测体系。结果表明,定量体系具有较好的重复性,用标准分子确定的转基因水稻“Bt汕优63”的检测极限为100个拷贝数。3.利用RT-PCR的方法检测了转基因水稻“Bt汕优63”整个生育期外源标记基因、目的基因在mRNA水平上的表达情况,检测结果显示,外源标记基因在整个生育期没有表达,目的基因稳定表达。在此基础上,建立目的基因在mRNA水平上表达的定量检测体系。实验结果表明,定量体系重复性较好,苗期目的基因表达的量较少,其他生育期目的基因稳定表达。4.以标准分子作为定量PCR外部标准品并建立标准曲线。本文利用重组PCR的技术构建了标准分子,检测含有转基因成分的混合样品,根据标准曲线计算转基因成分的含量;区分转基因水稻“Bt汕优63”与“华恢1号”样品;以构建好的标准曲线检测目的基因在mRNA水平上的表达量。结果表明,以标准分子作为定量标准品的检测结果具有较好重复性和再现性,重组PCR技术用于构建标准分子是可行的。本文的研究内容通过对转基因水稻Bt汕优63外源插入结构的研究,成功建立了针对转基因水稻Bt汕优63转化事件特异性PCR定量检测方法,望为转基因水稻的监管提供技术支持,为今后我国转基因作物及其产品检测标准的制定,转基因作物及其产品的定量检测试剂盒的开发提供技术支持。建立了目的基因cry1Ab/c在转录水平mRNA表达的定量检测体系,这将为准确、高速的检测转基因水稻Bt汕优63目的基因在转录水平上表达及其相关标准的制定和其安全性管理提供参考依据。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
第一章 前言  10-25
  1.1 转基因作物与其生物安全性  10-12
    1.1.1 转基因产品  10
    1.1.2 全球转基因作物的种植情况  10-11
    1.1.3 转基因作物的安全性  11-12
  1.2 转基因作物检测技术研究进展  12-20
    1.2.1 PCR 检测技术的研究进展  12-18
    1.2.2 酶联免疫吸附检测技术的研究进展  18-19
    1.2.3 其它检测技术的研究进展  19-20
  1.3 转基因水稻的培育情况  20-23
    1.3.1 水稻的遗传转化  20-21
    1.3.2 水稻遗传改良的性状  21-23
    1.3.3 我国转基因水稻的培育情况  23
  1.4 研究的目的和研究内容  23-25
    1.4.1 研究目的  23-24
    1.4.2 研究内容  24-25
第二章 转基因水稻BT 汕优63 的外源插入结构验证  25-37
  2.1 实验材料  25-26
  2.2 实验方法  26-31
    2.2.1 温室水稻的种植  26
    2.2.2 水稻总DNA 的小量提取  26-28
    2.2.3 水稻DNA 的扩增性检测  28
    2.2.4 外源转基因成分的PCR 检测  28-29
    2.2.5 长链PCR（long distance PCR，LD-PCR）  29-30
    2.2.6 品系特异性检测  30-31
  2.3 结果与分析  31-35
    2.3.1 水稻基因组DNA 的提取和内源actin 基因的验证  31-32
    2.3.2 转基因水稻Bt 汕优63 外源基因整合的定性PCR 检测  32-33
    2.3.3 转基因水稻Bt 汕优63 外源基因的构造检测  33-34
    2.3.4 旁侧基因组序列的验证  34-35
    2.3.5 水稻Bt 汕优63 自交下一代分离比的检测  35
  2.4 结论与讨论  35-37
第三章 转基因水稻BT 汕优63 品系特异性定量PCR 检测体系的构建  37-55
  3.1 材料与试剂  37-38
    3.1.1 材料  37
    3.1.2 生化试剂及配置  37-38
  3.2 实验方法  38-44
    3.2.1 水稻DNA 的大量提取  38-39
    3.2.2 制备不同含量的转基因水稻Bt 汕优63 样品  39
    3.2.3 引物设计  39-40
    3.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳  40-41
    3.2.5 构建标准分子  41-44
    3.2.6 SYBR Green 实时荧光定量PCR  44
  3.3 结果与讨论  44-52
    3.3.1 制备不同转基因水稻含量的混合样品  44-45
    3.3.2 优化3′端侧翼序列引物  45-46
    3.3.3 转基因水稻Bt 汕优63 转化事件特异性定量检测  46-52
  3.4 结论与讨论  52-55
第四章 转基因水稻BT 汕优63 外源基因MRNA 水平表达检测  55-68
  4.1 材料与试剂  55-56
    4.1.1 材料  55
    4.1.2 实验试剂  55-56
    4.1.3 引物设计  56
  4.2 实验方法  56-57
    4.2.1 水稻叶片RNA 的提取  56
    4.2.2 RNA 电泳  56-57
    4.2.3 反转录体系  57
    4.2.4 PCR 反应体系  57
    4.2.5 构建标准分子  57
    4.2.6 SYBR Green 实时荧光定量PCR  57
  4.3 结果与分析  57-66
    4.3.1 提取总RNA 浓度测定及电泳结果  57-58
    4.3.2 外源基因RNA 表达的RT-PCR 检测  58-61
    4.3.3 标准曲线制作  61-65
    4.3.4 转基因水稻不同时期目的基因mRNA 水平表达的定量检测  65-66
  4.4 讨论  66-68
第五章 全文结论  68-69
  5.1 转基因水稻外源结构的初步检测和验证  68
  5.2 建立转基因水稻转化事件特异性定量检测体系  68
  5.3 建立转基因水稻目的基因 mRNA 水平上表达的定量检测体系  68-69
参考文献  69-77
致谢  77-78
作者简介  78

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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