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新型二聚体蝎型探针定量检测沙眼衣原体方法的建立

作　者: 夏乾峰
导　师: 涂植光；刘预
学　校: 重庆医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 沙眼衣原体二聚体蝎型探针实时PCR 定量
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 40次
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内容摘要

目的:目前,沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)检测的方法为基于Taqman探针技术的荧光定量PCR,该法具有敏感度高和特异性好等优点而广泛应用于临床。但是,Taqman探针技术存在以下两大问题:一是由于探针两端同时标记荧光染料,所以合成和纯化成本较高;二是检测过程需要三步:变性、杂交、延伸水解,检测时间较长。二聚体蝎型探针分别标记荧光染料于互补的两段单链DNA上,从原理上克服了Taqman探针标记和纯化难度大等缺点而降低了成本;在检测步骤上省去了酶水解过程,可缩短检测时间。本研究拟建立一种快速、准确、价廉、操作简便,以二聚体蝎型探针荧光定量PCR技术为基础的检测CT方法。方法:采用基因克隆技术,将CT保守序列主要外膜蛋白基因(MOMP)克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为DNA标准品。根据MOMP基因序列设计二聚体蝎型探针,优化定量PCR体系。采用4个标准品系列和1个阳性标本,对其批内变异系数(CV)和批间变异系数进行测定;采用肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、15种标准血清型CT及16种生殖道常见病原体对其特异性进行测定;用该检测系统与两种FDA认证的分子诊断方法,分别对148例临床标本进行检测,根据CT诊断的“扩大金标准”,三种方法中任何两种方法阳性即判为该标本为CT感染标本,对本检测方法的临床检测性能进行评价。结果:1)成功构建了重组质粒。2)建立了基于二聚体蝎型荧光探针的荧光定量PCR方法,其线性范围为25~1010copies/反应管;不同浓度样本的批内CV范围为4.92%~21.73%,批间CV范围为6.94%~27.17%;特异性为100%。3)初步临床应用证明,该方法能够一次准确地诊断98.6%的临床确诊标本,是一种快速、易于操作的用于沙眼衣原体感染的分子诊断新方法。结论:建立了以二聚体蝎型荧光探针技术为平台的沙眼衣原体荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法。对所建立的方法进行优化及方法学评价,研究表明该方法具有结果可靠、检测速度快、特异性敏感性高、试剂成本较低廉的优点。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
论文正文新型二聚体蝎型探针定量检测沙眼衣原体方法的建立  12-49
  前言  12-16
  第一部分 MOMP 基因质粒标准品的制备  16-26
    1 主要仪器设备及主要试剂的配制  16-18
    2 实验方法  18-21
    3 实验结果  21-24
    4 讨论  24-26
  第二部分二聚体蝎型探针FQ-PCR 检测CT 方法的初步建立  26-38
    1 实验材料  26-27
    2 实验方法  27-33
    3 实验结果  33-36
    4 讨论  36-38
  第三部分临床检测性能评价  38-44
    1 实验材料  38-39
    2 实验方法  39
    3 实验结果  39-41
    4 讨论  41-44
  全文总结  44-45
  参考文献  45-49
文献综述  49-56
致谢  56-57
攻读学位期间发表的论文  57

新型二聚体蝎型探针定量检测沙眼衣原体方法的建立

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